蛋清P27抗原高阳性率对禽白血病诊断分析

薛晓阳 朱彤彤 程自珍 李佳佳 王雪敏

（华裕农业科技有限公司 河北 邯郸 056000）

禽白血病(A vianleukosis virus，ALV)是由禽C型反录病毒群的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要是淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。禽白血病的传播方式分为垂直传播及水平传播，其中经卵垂直传播是禽白血病的主要传播方式，家禽感染禽白血病后可造成鸡只生长发育迟缓、产蛋性能下降、免疫抑制等影响[1]。同品种鸡的饲养呈现规模化、集约化发展，蛋鸡、地方品种鸡感染J亚群ALV的病例报道不断增多[2]。禽白血病导致的经济损失主要有2个方面：一是产生肿瘤，导致鸡的死亡；二是产生非肿瘤综合征。此外，禽白血病一当感染后，可引起鸡群的免疫抑制，会继发诸如马立克氏病、传染性法氏囊、鸡传贫等免疫抑制病，从而造成更严重的损失[3]。本检测病例具有典型临床症状，主要表现为高死亡率，解剖为肝脏肿大，怀疑为肿瘤性疾病，因此对该场区采集鸡蛋进行P27抗原检测，评估该疾病和白血病的关系。其中该场区共有4个栋舍，全部进行采样评估。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 DF-1细胞 山东农业大学肿瘤与免疫抑制病实验室惠赠。肝素钠抗凝管购自江苏宇力医疗器械有限公司，EDTA-K2抗凝管购自山东省成武县医用制品厂。6孔细胞培养板购自美国康宁公司。DMEM高糖培养基生产厂家gibco，产品货号8119159，有效期至2020.5。0.25胰酶，生产厂家gibco，产品货号2008319，有效期至2020.9.30。青链霉素生产厂家gibco，产品货号2068817，2020.1.30。两性霉素B生产厂家procell，有效期至2020.6。胎牛血清：PAA品牌，生产日期SF181212。

1.1.2 试验设备 二氧化碳培养箱(松下，型号MCO-18AC)、倒置显微镜(NⅠKON，型号TS2)、高压灭菌锅(博讯，型号YXQ-LS-50SⅠⅠ)、超纯水系统(艾科浦公司生产，型号AWL-0501-H)、电热干燥箱(上海博讯生产，型号GZX-9140MBE)、超净工作台(上海博讯公司生产，型号SW-CTLFD)、医用离心机(湘仪设备，型号H1850)、酶标仪(BⅠOTeK品牌，型号ELX800)、洗板机(BⅠOTeK品牌，型号ELX50)、移液器(eppendorf品牌)。

1.1.3 试剂 LLAg试剂盒(ⅠDEXX产品，货号LP244，有效期至2020.5.18)。

1.1.4 鸡蛋 4个栋各采集184鸡蛋。

1.1.5 血样 第4栋采集30份全血。

1.2 检测方法

1.2.1 蛋清P27抗原检测 严格按照ⅠDEXX试剂说明进行。

1.2.2 样品处理及接种细胞[4]（1）抗凝血：1500-2000r离心2min，取中间靠下层，注意不要取到红细胞。本检测使用12孔板接90μl，每孔加入过滤的肝素钠抗凝剂20μl(12.5U/ml)。（2）接种完样品后2h更换维持液，用灭菌的PBS清理清洗细胞板3次，每孔1ml/次，加入1%细胞维持液维持5d，维持5d后进行传代。（3）共传2代，每一代的上清液都要留样检测。

1.2.3 细胞上清液白血病检测 试剂为ⅠDEXX产品，严格按照试剂说明进行。

2 检测结果

2.1 蛋清P27蛋白

表1 蛋清P27蛋白检测结果

2.2 全血白血病病毒

表2 全血白血病病毒分离结果

3 讨论

（1）该场区2个栋舍蛋清白血病P27抗原检测阳性率均较高，在30%以上，国家规定的蛋种鸡抽检不超过1%的阳性率，超标较为严重，并且鸡群存在肿瘤症状及较高死淘率。（2）2个栋舍采集全血进行病毒分离，随机采样，结果均在10%以上病毒检出，表明鸡群存鸡群确实存在病毒感染，并且DF-1细胞可以排除内源性白血病，因此该分离株是致病性白血病可能性较大。（3）ALV-J引发的肿瘤/血管瘤给中国养鸡业带来了很大的危害。过去十多年全国已报道了100多个ALV-J毒株的分离鉴定，同时何爱飞等也有禽白血病所致血管瘤的报到[5]，王培坤等在三黄鸡临床血管瘤病例分离出A亚群与J亚群白血病病毒，说明临床血管瘤有一定的病例，但是在一般企业实验室诊断全面诊断技术较为困难，病理切片技术相对复杂，并且在结果读取专业性要求较高，PCR方法白血病鉴定对分子理论要求较高，而细胞培养结合ELⅠSA联合诊断在企业应用较为适用。

4 结论

本案例白血病临床解剖不一定有明显的肿瘤症状，鸡群存在肿瘤症状，鸡蛋蛋清高阳性率，本病例达到30%以上，结合病毒分离得出高蛋清P27阳性率，对疾病确诊有指导意义，同时蛋清P27抗原检测检测较为方便，更适合基层化验室使用。