大黄酸联合高压氧对大鼠CCL4致肝纤维化的影响

孙昂昂，刘东璞

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154000；2.佳木斯大学 基础医学院，黑龙江 佳木斯 154000)

HF是慢性损伤长期反复刺激肝脏的反应过程，基本因素是肝细胞的坏死，中心环节是肝星状细胞(HSC)的激活与增殖。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠60只(180～220 g)，由佳木斯大学实验动物中心提供，大黄酸粉剂，高压氧装置，兔抗鼠TGF-β1抗体、α-SMA抗体，莱卡光学显微镜

1.2 方法

空白对照组(O组)：仅花生油腹腔注射及生理盐水灌胃；

模型对照组(S组)：首次以 3 mL/kg CCL 4溶液(精制花生油配置)腹腔注射，以后均 2 mL/kg 腹腔注射，2次/周，共6周；

大黄酸治疗组(R组)：诱导肝损伤同模型组，首次腹腔注射 CCL 4油剂三天后大黄酸灌胃100 mg/kg，2次/周；

高压氧治疗组(H组)：诱导肝损伤同模型组，首次腹腔注射 CCL 4油剂三天后高压氧1 kPa 1 h/次，2次/周；

大黄酸联合高压氧治疗组(RH组)：诱导肝损伤同模型组，在给予高压氧的同时给予大黄酸，时间和剂量不变。

每7天处死1只模型对照组取肝脏组织作肝脏病理学检查，按照《病毒性肝炎防治方案》评判肝纤维化程度[1]，直到模型建立成功。

肝功能检测于造模成功后分别尾静脉采血，全自动生化分析仪检测ALT、AST。

HE染色6周造模成功后，处死取大鼠同一部位肝组织，制备石蜡切片、HE染色观察形态学改变。

1.3 免疫组化法检测阳性细胞数

按试剂盒说明书操作，免疫组化检测TGF-β1、α-SMA蛋白表达，均定位在胞质，为棕黄色颗粒样着色。采用IPP 6.0图像分析软件计数。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0软件，数据以 x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P< 0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中ALT、AST水平

各实验组均较O组升高(P<0.05)，说明肝脏均有不同程度的损伤；S组表达增加，H组、RH组较S组升高(P<0.05)，R组较S组降低(P<0.05)；RH组较H组降低，较R组升高(P<0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠血清中ALT、AST水平

注：*表示与O组比较，P<0.05；#表示与S组比较，P<0.05；△表示与RH组比较，P<0.05。

2.2 肝脏病理学改变

O组肝小叶结构正常；H组大量炎细胞浸润，纤维组织增生明显，分割破坏肝小叶；RH组肝小叶结构紊乱，较多炎细胞浸润，纤维组织增生仅次于H组；S组纤维组织有纤维间隔形成，小叶结构部分存在；R组汇管区和周围纤维组织轻度增生(见图1)。

图1 各组大鼠肝脏组织病理改变(×400)

2.3 免疫组化结果

各实验组阳性细胞数均较O组升高(P<0.05)，S组表达增加，H组、RH组较S组升高(P<0.05)，R组较S组降低(P<0.05)；RH组较H组降低，较R组升高(P<0.05)(见表2，图2、3)。

表2 免疫组化检测肝脏组织TGF-β1、α-SMA蛋白表达阳性细胞数

注：*表示与O组比较，P<0.05；#表示与S组比较，P<0.05；△表示与RH组比较，P<0.05。

图2 各组大鼠肝脏组织TGF-β1蛋白表达(×400)

图3 各组大鼠肝脏组织α-SMA蛋白表达(×400)

3 讨论

各实验组血清ALT、AST检测均较O组升高，说明肝脏有不同程度的损伤；HE染色：各实验组均有不同程度的炎细胞浸润，小叶结构紊乱，纤维组织增生，间隔形成；肝功能血清学检测和病理学改变表明肝纤维化模型制备成功。

TGF-β1，是最广泛和最深入研究的亚型，也是最强的致肝纤维化因子，是介导肝损伤及纤维化的最关键的细胞因子[2]，肝损伤后，TGF-β1表达会显著增加。

HSC受细胞因子或炎症因子刺激，引起表型改变，迁移复位产生过量的α-SMA，被认为是肝纤维化发病的关键事件。故α-SMA可作为HSC活化的特有标志性蛋白[3]。

各实验组TGF-β1、 α-SMA蛋白均较O组升高，S组蛋白表达增加，H组、RH组较模型组升高，R组较模型组降低，RH组较H组降低；表明大黄酸可以抑制肝纤维化，其作用机制与其抗氧化、抗炎作用有关，拮抗CCL4的毒性作用，抑制TGF-β1的活性及抑制HSC活化、抗肝细胞凋亡坏死、保护内皮细胞、抑制成纤维细胞增殖及胶原合成等方面有关[5]。

研究表明，肝硬化病人30%～70%存在局部氧供应不足的现象，供血及供氧不足会导致肝损伤加重[6]，影响细胞内线粒体的代谢，而高压氧治疗可以迅速改善组织缺氧。但是，本实验中H组肝纤维化加重，RH组肝损伤较S组重，说明高压氧加重肝损伤大于大黄酸的抑制肝纤维化作用。可能与以下研究有关，CCL 4可以与氧气反应生成CCL3O2·，导致细胞膜的脂质过氧化作用和细胞膜破坏，处于高压氧状态下会生成更多的CCL3O2·，损伤肝细胞[7]；单用高压氧导致体内氧自由基增多，故需联用自由基清除剂[6]；在高压氧肾移植后缺血再灌注治疗中5 h组血清肌酐较1 h、3 h组低[8]，因高压氧使用时间不同而产生结果的差异。Nakai，Sun Y[9-10]等国内外文献已有论述高压氧可以迅速改善组织缺氧、减轻肝细胞损伤和炎症化，可以从以上几个方面继续探究实验结果与预期的差异，进一步深入研究，为肝纤维化药物的研究提供实验依据。