膜吸附在蛋白分离领域的应用

李 昱，叶 卉，张玉忠，李 泓

(天津工业大学 材料科学与工程学院，天津 300387)

蛋白质作为生命组成的必不可少的部分，不仅在生物体内具有重要意义，如催化、运输、免疫和调节等，而且蛋白工程作为五大工程之一，在生物制药、临床治疗、食品工业等也应用广泛。随着蛋白领域研究不断深入，人们对蛋白的纯度和需求不断提高，对蛋白的分离和提纯方法也越来越多，分离方法主要是基于蛋白的分子尺寸、溶解度、电荷及亲和性能等机理进行的[1-3]。目前为止，通过各种分离方法包括：透析与超滤、密度梯度离心、盐溶和盐析、等电点沉淀、层析和膜吸附等已经取得了较好的成果[4-7]。

膜吸附是膜技术与吸附技术相结合的集成技术，采用具有一定孔径的膜作为介质，嵌入/连接功能颗粒或配基，利用功能颗粒或配基与目标分子之间的相互作用进行分离纯化，当料液以一定流速流过膜时，目标分子与膜介质表面或膜孔内功能颗粒或基团特异性结合，而其余料液则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱[8-9]。具有分离速度快、易于工业放大、产量高、操作压力低等优点，在蛋白质、氨基酸、酶等生物大分子分离纯化、中药制剂的提取与纯化、血液中有毒物质的吸附分离等方面均有广泛应用[10]。

1 膜吸附剂的制备

膜吸附剂的制备方法可分为表面功能化与基质混合方法，主要制备方法包括：(1)通过改性原材料，制备带有配基的亲和材料，然后通过纺制或刮涂等方法成膜，但这种方法会降低原始材料的成膜性。(2)采用接枝反应将特定的官能团接到亲和膜表面，这种方法可以灵活地进行配基的固定[11]。(3)使带有配基的亲和材料与基体材料共混制膜，这种方法达到的配基密度通常要高于表面接枝改性，并且能够更好的稳定配基，但难点在于材料本身的相容性，以及相容后对材料的成膜性的影响。

Tetala K K R[12]等制备出了一种20～40 μm大小的Cu2+和亚氨基二乙酸改性的固定化颗粒(Immobead)，将其共混掺杂在乙烯-乙烯醇共聚物(EVAL)聚合物中制备出一种具有亲和吸附牛血红蛋白(BHb)的杂化膜(MMMs)。在牛血清白蛋白存在的情况下，由于MMMs带有铜离子，对于牛血红蛋白(BHb)具选择性吸附，而EVAL膜对牛血红蛋白和牛血清白蛋白的非特异性吸附较低。使用pH值6.8的缓冲液，即牛血红蛋白的等电点处时，血红蛋白有明显的吸附，混合基质膜吸附BHb的最大静态吸附容量为219.5 mg/g，吸附等温线为Langmuir型。混合基质膜从含有等量两种蛋白质的二元混合物中，对牛血红蛋白的选择性吸附是牛血白蛋白的三倍。

何俊勇[13]等将锆金属有机骨架Zr-MOFs负载在氧化铝基底上，制备出了一种能够快速吸附水中氟化物的功能膜。这项研究表明，膜比表面积为740.28 m2/g，吸附符合Langmuir等温吸附模型，而吸附动力学遵循伪二级模型。当初始氟化物浓度为200 mg/L时，在pH值7.0时最大吸附容量为102.40 mg/g。

Zhao R[14]等将支化聚乙烯亚胺接枝在电纺聚丙烯腈纤维膜上，制备了一种具有物理/化学稳定性，生物相容性和对胆红素有较强的吸附能力的吸附功能膜材料(bPEIPANFM)。对游离胆红素溶液和BSA结合胆红素溶液的分批吸附实验表明bPEIPANFM在水热温度为160℃，水热时间为10 h，bPEI与PAN的重量比为10∶1时，显示出对胆红素的最佳去除能力，对BSA结合胆红素的最大吸附容量为112.87 μg/g。经过十个再生周期，去除效率仍可保持95%。

He M[15]等基于表面引发原子转移自由基聚合技术制备了一种新型的磷酸化Zr4+固定化金属亲和膜(IMAM)，用于选择性吸附磷蛋白。通过使用标准磷蛋白(β-酪蛋白和卵清蛋白)和非磷蛋白(牛血清白蛋白和溶菌酶)的混合物作为模型样品，评估了磷酸盐Zr4+IMAM的吸附能力和选择性。吸附等温线和选择性吸附结果表明，磷酸Zr4+IMAM对磷酸蛋白的结合能力和选择性高于非磷酸蛋白。此外，磷酸盐-Zr4+IMAM表现出良好的重复使用性和再生产性。

2 膜吸附剂在蛋白分离中的应用与发展

随着蛋白分离技术的不断提升，新型的膜吸附剂不断向吸附量大，特异性高的方向发展和提高。Hamid Esfahani[16]等将尼龙纤维与带正电的锌离子改性羟基磷灰石(Hap)纳米粒子结合在一起，制备出一种Hap/尼龙吸附功能膜(图1(a))。对蛋白吸附进行测试，结果如图1(b)所示，随着纳米粒子在尼龙结构中的引入，尼龙膜吸附BSA的能力增强，最高吸附量为64.41 mg/cm3。使用Langmuir和Freundlich方程对实验等温线数据进行了进一步分析，发现Hap/尼龙吸附功能膜对BSA的吸附符合Langmuir方程吸附平衡模型。

图1 (a)Hap/尼龙吸附功能膜制备以及对BSA的吸附原理示意图；(b)不同N-ZH粒子掺杂量杂化膜对BSA的吸附量[16]

Fig.1 (a) Schematic diagram of the preparation of Hap/nylon adsorption functional membrane and the adsorption principle of BSA; (b) The amount of BSA adsorbed by hybrid membrane with different doping amounts of N-ZH particles[16]

Dong[17]等通过ATRP发制备了一种以聚甲基丙烯酸为支架，可以吸收模板蛋白的蚀刻PET膜。使用紫外线引发交联聚丙烯酰胺形成了交联的水凝胶，模板洗脱留下了活性位点作为目标蛋白的识别位点。对免疫球蛋白(IgG)吸附测试，吸附IgG的容量为8 mg/cm3。

吴超超[18]等采用水热法制备了一种生物相容性好、比表面积大、无毒、表面存在大量的羟基，且对血红蛋白具有特异性吸附的纳米ZrO2，将其与聚偏氟乙烯(PVDF)共混，制备出一种ZrO2/PVDF吸附功能膜。对BSA的吸附进行了性能测试，结果表明其最大吸附量为120 mg/g。

Avramescu[19]等通过将各种类型的Lewatit离子交换树脂掺入EVAL中制备吸附膜，并对蛋白质分子尺寸相近的BSA和Hb作为模型蛋白进行吸附分离研究。实验结果表明，该吸附功能膜对BSA的最大吸附量为135 mg/g，并且通过改变洗脱时的pH或离子强度等条件可使BSA的回收率达90%。制备的吸附功能膜具有良好的抗污染性能，可多次的进行蛋白质的吸附脱附实验。

张玉忠[20]等在EVAL中掺入Lewatit离子交换树脂(CNP80)，通过调控CNP80含量和相分离的方法制备具有不同吸附容量的Lewatit树脂填充EVAL吸附剂，并用BSA为模型蛋白进行吸附和脱附的性能研究。实验结果表明当CNP80填充量为65%时，树脂填充中空纤维膜吸附剂对血红蛋白的吸附量高达到54.84 mg/g。

黄莉兰[21]等将甲基丙烯酸二甲基氨基乙基酯(DMAEMA)接枝到乙烯-乙烯醇共聚物(EVAL)膜上，制得一种可以通过电荷差别分离牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白(BHb)分离膜。结果证明P(DMAEMA)具有可电离叔胺基团的弱阳离子聚电解质，有助于BSA和BHb的电荷选择性分离。在pH值6.0时，接枝的EVAL膜表面带正电，BSA带负电，而BHb带正电。由于静电相互作用，BSA被吸附到膜上，而BHb穿过膜层，从而实现蛋白的分离。

3 总结

膜吸附技术可以快速、高产和低成本的分离提纯蛋白，在蛋白分离领域有着重要的意义。许多新型吸附功能膜不仅具有良好的耐酸碱性和通透性，同时具有优异的吸附性能和广阔的应用前景。但对于膜吸附过程，一些问题尚待解决，需要深入研究蛋白吸附过程中传质机理以及吸附模型分析，解决吸附过程中吸附剂泄露以及重复使用性能较低等问题。