4,5-咪唑二羧酸液相色谱分析的研究

王风义，王 辉

(1.绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152000；2.山东胜利生物工程有限公司，山东 济宁 272173)

4,5-咪唑二羧酸，又称咪唑-4,5-二羧酸、4,5-咪唑二甲酸、4,5-二羧基咪唑，白色结晶性粉末。熔点约280℃(分解为咪唑和二氧化碳)，溶于氨或碱溶液，不溶于水、乙醇、乙醚。主要用于合成用于合成头孢咪唑等原料药，也可用于配位化合物。由苯并咪唑开环氧化合成而得。其分析方法一般采用酸碱滴定化学法，由于4,5-咪唑二羧酸是较弱的二元酸，没有合适的指示剂且电位突跃不明显，其检测结果的重复性较差。目前，4,5-咪唑二羧酸液相色谱分析方法没有报道，所以，我们在多次实验的基础上，找到了给定的液相色谱分析的方法，本方法与之前的方法相比之下较为方便简洁和快速精准，与杂质分离效果较好，在对4,5-咪唑二羧酸工业品的工业所需分析中，起到了重要作用，取得了令人满意的结果。

1 实验部分

1.1 试剂

甲醇(色谱纯)；磷酸(分析纯)；超纯水；4,5-咪唑二羧酸标准品(98.5%)。

1.2 仪器

P230II型液相色谱仪(或其他型号的带可变波长紫外检测器的液相色谱仪)；色谱工作站(或色谱数据处理机)；酸度计；超声波发生器。

1.3 操作条件

色谱柱：250 mm×4.6 mm (i.d)不锈钢柱，内装sphersorb C1810 μm(或同种效果的色谱柱)；流动相∶V(甲醇)∶V(水) = 50∶50，用磷酸调pH值2.0；流速：0.6 mL/ min；检测波长：254 nm；柱温：室温；进样量：10 μL。

图1 样品液相色谱图

在给定的色谱条件下，4,5-咪唑二羧酸的保留时间为4.1 min。也可以对仪器中的参数进行适当的调整，以此获得更好地效果，典型色谱图见图1。

1.4 实验方法

(1)标准溶液的配制：准确称取0.06 g(准确至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸标准品于50 mL的容量瓶中，先加入约30 mL流动相，再逐滴加入0.5 mol/L的氢氧化钠标准溶液，加滴加边摇动，至溶液变澄清，超声波振荡后再用流动相定容，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤后备用。

(2)样品溶液的配制：准确称取约含0.06 g(准确至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸的样品于50 mL的容量瓶中，先加入约30 mL流动相，再逐滴加入0.5 mol/L的氢氧化钠标准溶液，加滴加边摇动，至溶液变澄清，超声波振荡后再用流动相定容，摇匀，0.45 μm滤膜过滤后待用。

(3)分析测定：在上述分析条件下，进标样待色谱基线稳定之后，直至相邻两针标样溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面积变化前后差距小于1.5%，按照一针标样，两针样品，一针标样的顺序进行测定。

1.5 计算

取两针标样溶液和两针样品溶液中4,5-咪唑二羧酸面积平均数。试样中4,5-咪唑二羧酸的质量分数X(%)按式(1)计算：

(1)

式中：A1—标样溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面积的平均值；

A2—试样溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面积的平均值；

m1—4,5-咪唑二羧酸标样的质量，g；

m2—试样的质量，g；

P —标样中4,5-咪唑二羧酸的质量分数，%。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱曲线和检测波长的选择

取之前配比好的少量4,5-咪唑二羧酸标样，用流动相稀释以后，用流动相作为参比，在200～260 nm波长范围内，以每2 nm为一个阶段测定一次吸光度，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，建立4,5-咪唑二羧酸标样吸收光谱曲线，如图2，由曲线可知，4,5-咪唑二羧酸的最大吸收波长分别为216 nm和232 nm。在最大吸收波长下，其灵敏度太高，不利于样品的称量，为了便于称样，我们选择254 nm作为检测波长。

图2 吸收光谱曲线

2.2 流动相的选择

分别选择了不同比例的甲醇和水为流动相，当甲醇与水比例为50∶50时，4,5-咪唑二羧酸标样与杂质分离较好且保留时间较小，但峰拖尾，调节流动相的酸度可改变拖尾情况，以pH值2时拖尾较轻，峰形对称度较好，所以我们选择甲醇+水=50+50且以磷酸调pH值2为流动相进行分析，典型的色谱图见图1。

2.3 线性范围的测定

称取0.01 g到0.09 g的标准品系列，按照实验方法配制溶液，在给定的色谱分析条件下，每个标样溶液进样3次，以称取的质量为横坐标，三次进样获得的4,5-咪唑二羧酸标样峰面积的平均值为纵坐标进行作图，得到线性相关曲线图，见图3，并求得回归直线方程为：A=267984m+1717.6，r2=0.9985，式中：A为峰面积，m为标样质量，r为相关系数。

图3 4,5-咪唑二羧酸线性相关曲线

2.4 精密度的测定

对同一个4,5-咪唑二羧酸样品，用给定的实验方法测定6次，分析数据见表1，由表1可知，本方法的标准偏差为0.70，变异系数为0.73%。

表1 精密度的测定

2.5 准确度的测定

按照添加回收率的测定方法，在已测得含量的样品中，添加一定量的4,5-咪唑二羧酸标准品，用给定的实验方法下进行分析，经计算，方法的平均回收率为100.02%。

由以上结果和不同实验室分析比对结果可知，本文给定的实验方法适用于4,5-咪唑二羧酸的含量检测。