TPPU 对缺血性脑卒中大鼠AQP4 蛋白的影响

黄攀，张琳蕾，易兴阳*，韩钊*

(1.德阳市人民医院，四川 德阳；2. 温州医科大学附属第三医院，浙江 温州)

0 引言

缺血性卒中是严重危害人类健康的重大疾病，发病率高，占所有脑卒中的80%左右，溶栓治疗和神经保护治疗是其两大主要治疗策略。然而，迄今尚无有效的神经保护剂获得临床指南推荐[1,2]，但是人类研发有效神经保护剂的探索一直没有终止。1-三氟甲氧基苯基-3(1-丙酰哌啶-4-基)脲[1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1 -propionyl-piperidin-4-yl)urea，TPPU] 是2012 年由加利福尼亚大学兽医学院分子生物科学中心Bruce 教授等合成的一种新型sEH 抑制剂[3]，在多种动物模型中显示其在抗炎和心、肾保护方面均优于传统sEH 抑制剂[4]。心脏动物模型研究也表明[5]，TPPU可预防心肌梗死后心肌纤维化，具有抗凋亡、抗氧化、保护线粒体等多种功能。但TPPU 在脑缺血后神经保护作用研究少，TPPU 是否具有脑保护作用。因此本试验主要探讨TPPU 对缺血性大鼠水通道蛋白(AQP4)及神经功能的影响。

1 研究方法

1.1 pMCAO 模型的制备

选取250-300g 左右的成年雄性SD 大鼠，采用Longa 线栓法制作。参照本研究小组以往的方法，水合氯醛(350mg/kg，腹腔注射)麻醉后，手术显微镜下分离左侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，充分游离ECA 主干，电凝其远端并切断，在残端剪一小口。采用0.26mm 尼龙鱼线头端去棱角钝化处理作为线栓，将制备好的尼龙栓线插入ICA 颅内段，当遇到轻微阻力时停止，结扎ECA 根部丝线。尼龙丝线插入深度为19-22mm，造成大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，让线栓持续阻塞，不拔出线栓，直到实验结束。假手术组线栓插入深度为10mm，栓线头端停留于ICA 内。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒，自由饮水、进食。在这些操作过程中，体温保持在(37±0.5)°C。局部脑血流量(rCBF) 可借助软质探针和激光多普勒血流测定仪进行测量。此模型制备操作简便、副损伤小、梗死灶部位恒定，可以满足研究的要求。

1.2 实验分组(每组12 只)

设空白对照组、pMCAO 模型组(pMCAO+DMSO)、pMCAO 模型+TPPU 给药组。pMCAO 模型+TPPU 给药组按照TPPU 浓度剂量分为为0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg 共4 个亚组。

1.3 干预方法

空白对照组、假手术组和MCAO 模型组均由腹腔注射相应剂量生理盐水，pMCAO 模型+ TPPU 给药组造模后即刻由腹腔注射相应浓度剂量的TPPU 干预。各组在造模后2h，进行Longa 法神经功能缺损评分，判断模型成功与否。0 分：正常，无神经损伤征象；1 分：动物不能完全伸展右前肢；2 分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象；3 分：行走时向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚；4 分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺损评分1-3 分为造模成功，0 分和4 分为造模不成功予以剔除，在后续实验中补充剔除的动物，保证每组动物数量。

1.4 观测指标

pMCAO 后24h 测定下列指标并进行组间统计学比较分析：

1.4.1 神经功能缺损评分

造模后2h、24h(处死动物前)采用Longa 法进行评分。

1.4.2 采用干湿质量法

脑缺血24h 后处死大鼠，快速断头取脑，滤纸擦去表面水分，取缺血侧半边大脑，置天平内精密称取湿质量，然后置110℃电烤箱24h，再迅速测干质量。计算脑含水量用湿重的百分比表示为：( 湿重- 干重)/ 湿重×100%。采用Western-blot 法检测AQP4 蛋白的表达量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，组间比较采用T 检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能缺损评分比较

造模后2h、24h(处死动物前)采用Longa 法进行评分，结果发现与Pmcao+DMSO 组比较，pMCAO+0.5mg/kg 组、pMCAO+2.0mg/kg 组 差 异 无 统 计 学 意 义(P＞0.05)，而pMCAO+1.0mg/kg 组、pMCAO+1.5mg/kg 组差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 各组脑组织AQP4 蛋白比较

与 Pmcao+DMSO 组 比 较，pMCAO+1.5mg/kg 组、pMCAO+2.0mg/kg 组 差 异 无 统 计 学 意 义(P＞0.05)，而pMCAO+0.5mg/kg 组、pMCAO+1.0mg/kg 组 差 异 有 统 计 学 意义(P＜0.05)。

3 讨论

图1 各组mNSS 评分比较

花生四烯酸(arachidonic acid，AA) 是人体内心脑血管活性物质的前体，其代谢产物与脑血管病的发病密切相关[5]。AA的细胞色素P450(cytochrome P450，CYP) 代谢通路是近年研究的热点[6]。AA 在CYP 羟化酶作用下生成羟基二十碳四烯 酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETEs)，在CYP 表 氧 化酶作用下生成环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid，EETs)，EETs 再经过可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH) 作用下生成生物活性较弱的二羟基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acid，DHETs)。HETEs 具有强力的脑血管收缩作用和促动脉粥样硬化作用。而EETs 具有扩血管、调节离子通道、抗动脉粥样硬化等多种生物学功能，对心脑血管具有保护作用。我们近期临床研究发现，AA 的CYP 代谢通路代谢产物(EETs 和HETEs) 水平与急性缺血性卒中后神经功能恶化密切相关[7,8]，提示它们在脑缺血性损伤中可能发挥重要作用。

血脑屏障(BBB) 的破坏是缺血性卒中的重要病理机制。星型胶质细胞参与对BBB 完整性的维持障碍。AQP4 主要分布于星型胶质细胞足突，是介导水进入脑组织的最主要蛋白。脑缺血损伤后，AQP4 表达升高，水通道开放，大量水分子进入细胞内形成细胞内水肿，引起血脑屏障破坏。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK 信号通路参与对水通道蛋白4 的调控。近年研究表明，细胞凋亡在脑缺血中可能起主导作用，脑缺血损伤后缺血半暗带产生的主要病理生理机制之一是细胞凋亡，线粒体结构和功能改变在细胞凋亡中起关键作用[9]。脑缺血后NCU 和BBB 损伤的线粒体细胞凋亡信号通路是目前关注的热点。

本研究结果表明，不同剂量的TPPU 对缺血性脑卒中神经血管单元具有保护作用，调控水通道蛋白的表达进而影响血脑屏障进而发挥保护神经血管单元是其可能机制之一。

图2 各组AQP4 蛋白比较