免疫组化阳性对照组织的选择

李真真，马钰

陕西省人民医院病理科，陕西 西安 710068

免疫组化技术在病理诊断中的作用十分重要，免疫染色结果的稳定性和可靠性依赖于免疫组化对照的设置[1-2]。无论是手工染色还是全自动免疫组化染色仪染色，任何不当的操作步骤均会影响染色结果，从而影响病理诊断，因此免疫组化染色中设立阳性对照至关重要[3]。根据对照结果可以判断免疫组化操作步骤是否正确、使用试剂是否可靠，从而确保技术最佳化和结果的有效性[2]。目前，NORDIQC 已对100 种病理科常用一抗进行了室间质控，并对其中87 种常用一抗提出了推荐对照组织。本文选取其中部分抗体，分别用各种不同的组织做为对照，观察其抗原表达情况。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取陕西省人民医院送检标本，其中包含肿瘤旁正常的扁桃体、阑尾、肝脏、肾脏、乳腺、结肠六种组织。这些组织经过10%中性缓冲福尔马林固定6～12 h 后梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸泡后包埋制作成阳性对照组织蜡块。将阳性对照块根据组织类型进行分类，并进行常规切片，厚度为4 μm，将切好的对照片分类储存。

1.2 试剂 一抗试剂中CD3、CD20、Ki-67购自罗氏诊断公司，其余一抗试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司，二抗及显色系统均购自罗氏诊断公司。

1.3 对照组织的选择 选取的组织经过连续切片后最后一张进行HE 染色观察,看是否含有合适相应抗原表达的区域，以保证各组织包埋面含有相应的组织成分。

1.4 对照蜡块的使用 将扁桃体、阑尾、肝脏、肾脏、乳腺、结肠组织分成A、B、C、D、E、F六组进行常规切片后与待测组织裱于同一张黏附载玻片上，83℃烤片20 min，分别进行40种不同抗体的免疫组化染色。

1.5 免疫组化染色 在罗氏BenchMark XT 全自动免疫组化染色机上设置40 种不同抗体的染色程序，将烤好的切片贴上标签，放于染色机内的独立温控板上进行免疫组化染色，手动滴加一抗，其他步骤均由机器自动完成。染色结束后，取出切片，将染好的切片进行梯度酒精脱水、树胶封片。

2 结果

2.1 A 组 扁桃体组织中CK、HCK、E-cadherin、P120、CK5/6、EMA、CK7、CK8/18、CK19、P63 在上皮细胞呈现阳性，Calponin、SMA、Caldesmon、Desmin、Vim 在血管内皮呈现细胞质阳性，ER 在鳞状上皮细胞和分散的生发中心巨噬细胞中呈现细胞核阳性，Ki-67、P16 在上皮细胞及生发中心均呈现部分细胞阳性，CD20、CD21、CD10、CD79α在淋巴滤泡生发中心呈现细胞膜阳性(图1A)，LCA 在所有的B 细胞和T 细胞均呈现细胞膜阳性，CD3、CD7 在副皮质区呈现细胞膜阳性，CD34 在血管内皮呈现细胞膜和细胞质阳性，D2-40 在淋巴管内皮中呈现细胞膜和细胞质阳性，CD38 在浆细胞中呈现细胞膜阳性，CD138 在浆细胞和鳞状上皮细胞中均呈现细胞膜阳性，S-100 在生发中心的滤泡树突细胞呈现细胞质和细胞核阳性。

2.2 B 组 阑尾组织中E-cadherin、P120、P504s、CK、CK8/18、CDX2、Villin、CK19、CK20 在腺上皮细胞呈现细胞质阳性(图1B)，CD38、CD138 在间质浆细胞中呈现细胞膜阳性，SMA、Calponin、Caldesmon、Desmin 在肌层肌纤维中呈现细胞质阳性，CD7、CD3在副皮质区部分淋巴细胞呈现细胞膜阳性，CD79α、CD10、CD20、CD21、LCA、ER 在淋巴滤泡生发中心呈现阳性，Syn、CgA、CD56、S-100 在肌层神经节细胞中呈现阳性，Vim、CD34 在血管内皮呈现细胞质阳性，D2-40在淋巴管内皮中呈现细胞膜和细胞质阳性。

2.3 C 组 肝脏组织中P504s、HEPY、P16 在肝细胞中呈现细胞质阳性(图1C)，CD38 在汇管区的浆细胞中呈现细胞膜阳性，CD138 在汇管区浆细胞和肝细胞中均呈现细胞膜阳性，SMA 在间质纤维中呈现细胞质阳性，HCK、CD56 分别在胆管中呈现细胞质和细胞膜阳性，CD7、CD79α、LCA 在间质淋巴细胞中呈现细胞膜阳性，E-cadherin、P120、CK 在肝细胞和胆管上皮细胞中均呈现细胞质阳性，Vim、CD34、Caldesmon 在血管肌层细胞中呈现细胞质阳性，CK7、Villin、CK19 在小胆管中呈现细胞质阳性，CD3、CD20 在汇管区淋巴细胞中呈现细胞膜阳性，D2-40 在淋巴管内皮中呈现细胞膜和细胞质阳性，CK8/18 在肝细胞和小胆管中均呈现细胞质阳性，Ki-67 在肝细胞、汇管区淋巴细胞呈现点灶状细胞核阳性，CD10 在肝细胞间的胆小管和小胆管中呈现细胞质和细胞膜阳性，S-100 在汇管区神经细胞中呈现细胞质阳性。

2.4 D 组 肾脏组织中E-cadherin、P120、CD138、P504s、CK、CK7、CD3、CK8/18、Villin、CK19、PAX-8 均在肾小管中呈现阳性，Vim 在肾小球血管内皮中呈现细胞质阳性，SMA、CD34、Caldesmon、Desmin、Calponin 在血管平滑肌中呈现细胞质阳性，CD10 在肾小球和肾小管中均呈现细胞质和细胞膜阳性(图1D)，Ki-67 在肾小球、肾小管和血管中呈现极个别细胞阳性表达。

2.5 E 组 乳腺组织中E-cadherin、P120、CK、CK7、CK8/18、CK19、ER、PR 在导管上皮细胞中呈现阳性(图1E)，SMA、P63、CK5/6、CD10、Calponin、S-100在肌上皮细胞中呈现阳性，Vim、CD34 在间质细胞中呈现细胞膜阳性，P16 在肌上皮细胞及间质细胞中均呈现阳性，D2-40 在淋巴管内皮中呈现细胞膜和细胞质阳性，CD138、HCK 在腺上皮和肌上皮细胞中均呈现阳性，SMA 在平滑肌细胞中呈现细胞质阳性，Ki-67 在部分腺上皮中呈现细胞核阳性。

2.6 F 组 结肠组织中E-cadherin、P120、CK、CK8/18、CDX2、Villin、CK19、HEPY 在腺上皮细胞中呈现阳性(图1F)，CD138、CD38 在浆细胞中呈现细胞膜阳性，SMA、Calpinin、Caldesmon、Desmin 在平滑肌细胞中呈现细胞质阳性，Syn、CgA、CD56、S-100 在肌层神经节细胞中呈现阳性，CD34、Vim 在血管内皮中呈现阳性，CD79α、CD20、CD21 在淋巴滤泡生发中心呈现细胞膜阳性，CD7、CD3、LCA 在副皮质区呈现细胞膜阳性，D2-40 在淋巴管内皮中呈现细胞质阳性，Ki-67 在生发中心和基底层细胞中呈现细胞核阳性。

图1 不同抗体在不同对照组织的表达

3 讨论

免疫组织化学技术在病理诊断中的作用极为重要，良好的染色结果能帮助病理医生更准确地进行病理诊断,不当的染色结果可能会引起漏诊或者误诊。染色过程中需要经过多个步骤的操作,每一个步骤操作不当都会影响染色结果进而影响病理诊断的准确性[3]。因此，免疫组化染色的标准化和规范化是实验室的基本要求。手工染色容易受周围温度、湿度以及操作人员工作习惯影响，染色结果容易出现批次误差，稳定性较差。全自动免疫组化染色机染色着色均匀，背景干净，定位准确，无边缘反应，大大增加了染色结果的准确性和可靠性，但如果染色机在运行过程中出现滑片或产生气泡等现象，就会对染色结果造成一定的影响，容易造成误诊。因此，无论是手工染色还是机器染色，在染色过程中设立对照是进行质控的重要措施之一，可以保证免疫染色过程中试剂的可靠性，操作的正确性，避免试剂失效，操作失当或机器故障引起假阳性或假阴性的结果[4]。

目前各个医院有不同的免疫组化对照选择。香港伊利沙伯医院陈国璋医师运用多种组织制作香肠包埋块阳性对照切片，效果较好，但对照组织面积大，消耗试剂多，制作过程也比较烦琐[5]，且收集标本所需时间周期较长，多种组织不易包埋于同一平面上，容易造成漏检。另外一些单位选择用组织芯片作为对照，组织芯片虽然抗体覆盖面广，且高通量的特点也使检测的准确性更高，同时更为节约组织，但组织芯片操作太过繁琐，对制作过程要求高，包埋容易形成空泡，如果使用专业设备进行取材，又大大增加了工作成本[6]。相比较而言，单组织对照较易取材，面积较小，成本较低，更加节约试剂，适合基层机构开展，其制作过程相对简单，相同的组织量，单组织对照蜡块可以切出更多的阳性对照片，相比较其他两种对照方法，更加节约组织。

关于对照组织选择的临床研究，应该遵循以下原则：(1)同一个病例在做多种免疫组化标记时尽可能地选取同一种组织；若一种组织无法满足需求时，可选择两到三种不同组织做为同一病例不同抗体的对照；(2)鳞状上皮和淋巴系统标记指标可选择扁桃体做为阳性对照；(3)平滑肌标记指标、腺上皮标记指标和神经内分泌系统标记指标可选择阑尾做为阳性对照；(4)正常肝脏、肾脏、乳腺、肠管组织可做为相应组织恶性肿瘤的阳性对照。因为同种组织在染色过程中的内环境相同，染色强度及着色部位也相同，更能准确客观地反映出组织中抗原与检测抗体的结合情况，所以更适合做为同类组织的阳性对照。

有研究对100 种病理科常用抗体进行室间质控，并给出了这些抗体推荐的阳性对照和阴性对照组织类型，其中推荐比较多的为扁桃体和阑尾组织[7-12]。通过对6 组不同组织染色结果进行分析后可以得出，扁桃体和阑尾可做为大部分抗体的阳性对照。具体来说，扁桃体可做为鳞状上皮和淋巴系统以及血管和淋巴管相关抗体的阳性对照，阑尾可做为平滑肌、腺上皮、神经内分泌系统、淋巴系统以及血管和淋巴管等相关抗体的阳性对照，其余四种组织则比较适合作为同组织类型肿瘤相关抗体的阳性对照。

综上所述，在工作中选择合适的单组织作为阳性对照，是提高免疫组化可靠性的值得推广的对照方法。