热应激蛋白与病毒免疫应答研究进展

张 蕾，张培军，郭曦尧，李月红*

（1. 吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118；2. 教育部动物安全生产重点实验室，吉林 长春 130118；3. 吉林省卫生监测检测中心，吉林 长春 130000）

热应激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是生命体处于应激状态时机体为维护蛋白质正常生理功能而产生的一类伴侣蛋白。1962 年，Ritossa 最早发现了热应激反应[1]，随后，Tissiere 在该反应中成功分离到由基因转录增强而形成的蛋白质并将其命名为热应激蛋白（又名热休克蛋白）[2]。由于热应激蛋白种类繁多，迄今为止尚没有具体的分类标准，所以根据其分子量大小和主要功能，可将热应激蛋白大致分为几种不同的家族，其中HSP90 家族、HSP70 家族、HSP60 家族、HSP40 等家族是热应激蛋白家族中研究最深入的几类[3-4]。热应激蛋白作为一种重要的伴侣蛋白，其产生伴侣活性的方式是在正常生理状况或应激状态下参与多肽在体内的合成转运防止蛋白质发生错误的折叠和聚集[5]。而当生命体受到外界胁迫时，热应激蛋白的表达模式会从基因水平上开始发生改变，形成的热应激蛋白可以识别变性蛋白的疏水区域，阻止变性蛋白发生不可逆折叠，使细胞从环境胁迫中得到恢复，保护细胞降低或免受应激伤害[6-7]。

热应激蛋白不仅在胚胎发育、信号传导、抗氧化、抗应激抗细胞凋亡等方面有明显的调节功能，在协同免疫方面也发挥着重要作用[8-9]。有些观点认为病毒通过侵占伴侣蛋白从而促进其在宿主细胞内的增殖。而Guan 等提出流感病毒是利用细胞伴侣这一途径来逃避宿主防御而不是利用它们来促进病毒的传播[10]。也有许多学者对热应激蛋白参与机体抗病毒感染免疫效应方面进行了相关研究，证实热应激家族成员在病毒复制过程中发挥了重要作用，其参与了病毒的穿入[11]，脱壳[12]、复制[13]、基因表达[14]、组装[15]和病毒粒子释放等病毒复制周期的不同阶段。病毒的侵染促进了动植物寄主或病毒自身基因组表达热应激蛋白，产生的热应激蛋白可与病毒蛋白结合在病毒复制过程中发挥重要作用，而病毒侵入也可改变热应激蛋白在细胞内的分布形式[16-17]。本文对热应激蛋白在病毒诱导免疫反应中的作用进行综述，旨在为动植物病毒病的预防及治疗提供新的解决方法和思路。

1 热应激蛋白HSP70 家族抗病毒侵染作用

HSP70 家族是热应激蛋白家族中最为保守的一类蛋白，也是研究最为深入的蛋白。非致死的HSP70 在人类、动物机体的一些疾病治疗、粘膜保护、抗肿瘤治疗等方面均具有十分重要的作用[18]。HSP70 在正常情况下表达量较少只有在应激刺激下表达才会显著升高，主要参与细胞内蛋白质降解调控过程，提高细胞耐受性维持细胞正常生理功能。研究表明，HSPs 可通过复制酶互作促进DNA 或RNA 病毒的复制，病毒也可上调寄主HSPs 水平[19]。如芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒、水稻条纹病毒等的侵染可提高番茄、烟草、水稻等寄主植物HSP70或热休克同源蛋白70 的丰度[20]。Swindell 等采用ATH1 微阵列平台，通过改变不同外界条件（包括病原刺激）作用拟南芥发现，高温、病原等对其嫩枝、叶片HSP70 表达均具有较强的诱导作用[21]。动物实验证明病毒感染可直接诱导机体内HSP70 蛋白的大量表达，过表达的HSP70 与病毒蛋白结合形成复合物，递呈病毒蛋白抗原，刺激机体产生抗病毒的免疫应答。已有大量文献表明HSP70 蛋白可以作为潜在的抗病毒作用靶点。Lahaye 等通过抑制HSP70 蛋白发现狂犬病病毒表达量显著减少，在感染细胞中纯化的核衣壳和纯化的病毒粒子中检测到HSP70 的存在，证明HSP70 蛋白可能参与了狂犬病病毒复制周期的某个阶段[22]。Taguwa 等通过免疫共沉淀和免疫印迹等方法验证了登革热病毒复制时在不同细胞里的不同步骤需要不同的热应激蛋白酶（DNAJ）辅助因子，HSP70 和DNAJ 在登革热病毒进入中发挥作用，HSP70 和DNAJB11 作用在病毒RNA合成时，HSP70 和DNAJB6 作用在病毒粒子产生过程中[23]。Hafrén 等研究表明HSP70 及其协同伴侣分子具有调控病毒蛋白外壳的功能，进而干扰病毒基因的表达[24]。潘颖等利用RNA 干扰（RNAi）技术特异性降低HepG2.2.15 细胞中HSP70 的表达量，结果显示细胞中乙型肝炎病毒DNA 含量和相关抗原（HBsAg）的分泌量显著降低，进一步说明HSP70 在病毒的生命周期中发挥重要功能[25]。细胞凋亡是机体内细胞为了维持内环境稳定而自我调整的一个主动的过程，是受基因调控的死亡过程。而热应激蛋白作为分子伴侣在细胞的新陈代谢中同样发挥了重要的作用，已有大量报道证明热应激蛋白参与细胞凋亡机制，是机体细胞存活的关键因素之一。Schmitt 等对人类白细胞的研究表明HSP70 抑制细胞凋亡从而增加暴露于各种致死刺激的细胞的存活率[26]。张育等研究表明HSP70 过表达能够促进星形胶质细胞的存活，抑制细胞的凋亡[27]。综上所述，HSP70 家族通过激活机体免疫应答，调节细胞凋亡，提高细胞抗逆性等方式协助机体抵抗病毒侵染。

2 热应激蛋白HSP40 家族抗病毒免疫效应

HSP40 家族在蛋白质的初级水平上非常多样化但总体上具体分为4 个结构域，高度保守的N 端J 结构域，富含甘氨酸和苯丙氨酸的G/F 结构域，富含半胱氨酸的锌结合结构域和保守程度较低的C 末端底物结合结构域[28]。基于这些区域的差异HSP40 家族可以被分为三类，Ⅰ型含有4 个结构域的蛋白质如与HSP40 同源的大肠杆菌共伴侣DnaJ，Ⅱ型缺乏锌结合结构域的蛋白质如人类HDJ-1 蛋白和Ⅲ型仅保留J 结构域的蛋白质如酵母sec63 蛋白[29]。除了上述结构域外，有些HSP40 家族成员还存在其他的结构域这形成了其功能的多样性。

HSP40 是热应激蛋白家族中跨物种存在的高度保守的蛋白家族，存在于细菌和人类的各种组织中[30]。HSP40 作为分子伴侣的主要功能是与蛋白底物特异性结合，HSP40 与未折叠的蛋白质结合并将其递送至与ATP 结合的HSP70，ATP 在HSP40 的刺激下水解，HSP70 的底物亲和力增加与目标蛋白牢牢结合，核苷酸交换因子促进HSP70 蛋白返回ATP 结合状态，这导致折叠蛋白的释放，重复该循环直至目标蛋白质正确折叠[31]。现如今对HSP40 的主要认识是HSP70 蛋白的辅助因子，参与转录、细胞成长和增殖等生理生化过程。越来越多的研究人员发现，HSP40 家族可直接作为伴侣蛋白参与病毒的复制繁殖等过程。有研究表明人类免疫缺陷病毒早期蛋白（Nef）可以与宿主编码的HSP40 蛋白结合并诱导其在被人类免疫缺陷病毒Ⅰ型病毒（HIV-Ⅰ）感染的宿主细胞中表达，当HSP40 蛋白表达量增多时缺失Nef蛋白的病毒生长速度开始下降[32]。乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）是一种多功能毒力因子，在病毒复制和肝细胞癌发展的过程中发挥重要作用。Sohn 等在人肝癌细胞HepG2 中实验发现HSP40 伴侣蛋白主要是通过蛋白酶体途径促进HBX 的降解从而抑制野生型HBV 的复制，HBX 蛋白是HSP40 抑制HBV 复制的主要靶点[33]。Sohn 等在原实验基础上进一步阐述了HSP40 蛋白抗病毒作用的分子机制，HSP40 伴侣家族蛋白成员Hdj1和hTid1的异位表达抑制了人肝细胞瘤细胞中HBV 的复制，通过RNA 干扰敲低hTid1 的表达量则导致HBV 的复制量增加，该研究同时证明HSP40 对病毒复制和病毒衣壳形成均具有抑制作用，并且能靶向增加目标蛋白的降解[34]。

3 热应激蛋白HSP60 家族抗病毒免疫效应

HSP60 是热应激蛋白家族中最为重要的成员之一，其同源性较高，广泛存在于原核及真核生物内，并且作为分子伴侣在天然免疫和获得性免疫中均发挥着重要作用。HSP60 可以直接激活天然免疫也可以通过与病原体相关分子模式结合激活获得性免疫。HSP60 同时也具有免疫调节特性，其作为趋化因子在细胞损伤处招募血液中的嗜中性粒细胞，刺激嗜中性粒细胞分泌抗菌酶类或直接增强巨噬细胞的活性[35]。近年来的研究表明，当病毒侵染机体时，HSP60 可与抗原短肽形成复合物或融合蛋白在呈递抗原时经MHC-I类途径加工，刺激机体产生特异性CD8+激活抗原特异性CTL 的第二信号[36]，它能够优先和变性蛋白结合从而保护细胞免受病毒胁迫。Yang 等将H1N1 病毒的MI基质蛋白和核蛋白与HSP60融合并在大肠杆菌中表达重组，纯化后通过鼻内免疫小鼠诱导细胞免疫反应，实验结果显示重组蛋白NP-M1-HSP60 显著抑制了小鼠肺中的病毒复制量并且保护小鼠在感染H7N9病毒时未致死[37]。Shan等的研究证明HSP60的过表达增加了抗凋亡Bcl-xl 和Bcl-2 的丰度，降低了促凋亡Bax 的蛋白含量，从而减轻阿霉素诱导的心肌死亡[38]。Murata 等研究发现线粒体迁移到单纯疱疹病毒（HSV）感染的细胞质中的核周区域同时促进了HSP60的表达，并在感染的中期保持抗病毒功能[39]。因此，HSP60 有望成为DNA 疫苗研制的重要候选之一。

4 热应激蛋白HSP90 家族参与病毒免疫效应

HSP90 是热应激家族中最活跃的分子伴侣之一也是家族中为数不多的含有内含子的成员，具有重要的生物学功能（表1）。HSP90 通常以二聚体的形式存在，并需要结合ATP 以发挥作用，HSP90 可以与基因启动子相应元件结合形成复合体进而与协同伴侣，类固醇受体，蛋白激酶等功能蛋白特异性结合从而改变蛋白的功能状态[40]。近年来的研究证明，HSP90 是病毒复制的一种重要宿主，能够影响病毒聚合酶的活性进而干扰病毒的复制，还有研究表明HSP90 通过对底物蛋白质的作用而影响病毒的侵染和发展[41]。Ian 等的研究表明HSP90 通过保持核因子κB 激酶（IKK）复合物功能来控制艾滋病病毒Ⅰ型（HIV-1）潜伏期的激活，从而将T 细胞活化后与HIV-1 复制连接起来[42]。Dipanjan 等的研究表明HSP90 通过调节细胞信号蛋白来调节轮状病毒并且强调了细胞蛋白在轮状病毒感染中的重要性，以及靶向细胞伴侣蛋白用以开发新的抗轮状病毒的可能性[43]。此外，HSP90 也可与病毒基因组互作，促进病毒复制。Gorovits 等以番茄为模型将HSP90 沉默，并将番茄黄化曲叶病毒侵染番茄，结果发现沉默处理组的番茄叶片不显症状，表明HSP90 有助于病毒复制[44]。Chase 等通过17-烯丙基氨基-去甲氧基格尔德霉素（17-AAG）和格尔德霉素（GA）抑制HSP90而促进了病毒蛋白的降解，GA 的增加导致3 种病毒RNA 的剂量依赖性降低，具体表现为mRNA、cRNA和vRNA，说明病毒RNA 的积累依赖于HSP90 蛋白含量[45]。Dipanjan 等通过下调HSP90 基因的表达成功的抑制了丙型肝炎病毒（HCV）在体内的复制，靶向病毒基因组的小干扰RNA（siRNA）与HSP90 mRNA 的结合也成功地减少了HCV 的复制，降低了病毒耐药性的发生[46]。王少华利用HSP90 的特异性抑制剂17-AAG能显著抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的增殖和表达，同时结果显示在病毒感染的早期抑制效果最明显[47]。当机体遇到病毒或细菌侵染时，体内HSP90 的表达水平显著区别于正常生理状态，但HSP90 的表达量是否可以用于评价机体的环境适应能力和应激能力仍然有待进一步的验证。

表1 热应激蛋白与病毒互作Table 1 Interaction between heat stress proteins and viruses

续表

5 小结与展望

热应激蛋白广泛存在于动物机体的各个器官，在机体抗应激损伤过程中发挥着至关重要的作用。作为一类高度保守蛋白，它参与了许多生理功能，除参与细胞周期控制、细胞增殖发育与凋亡，细胞存活的调节，增加细胞耐受性等生理过程之外，在免疫反应的抗原呈递和活化方面也发挥了重要作用。随着研究水平的逐渐深入，热应激蛋白与病毒的相互作用将会被越来越多的人认可，未来的研究很可能会在这一领域揭示更多的示例，以此加深我们对这些共同伴侣在病毒中的理解。当前，依据热应激蛋白特殊的生物学特性也完全可以为DNA 疫苗或某些广谱抗病毒药物的研制提供一定的方向和思路，并广泛用于治疗多种病毒性感染的疾病。而不同的热应激蛋白与不同的功能蛋白结合时，则会产生不同的作用效果和作用机制，因此我们还需在研制过程中准确评估和分析，相信这些相互作用同样可以为新的抗病毒策略提供目标。