左卡尼汀有关物质的合成

任继波，于建华，刘印，高莹，杨学谦

(山东齐都药业有限公司，山东省脑神经保护类药物重点实验室，山东临淄255400)

左卡尼汀(levocarnitine)是一种氨基酸衍生物，又称左旋肉毒碱，化学名为(R)-3-羧基-2-羟基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氢氧化物，结构式见图1，主要分布于心肌、骨骼肌中。左卡尼汀是能量代谢中必需的体内天然物质，其主要功能为促人体内脂类代谢，主要生物学作用是将长链脂肪酸从胞质转运至人线粒体基质，通过Krebs循环氧化产生ATP为细胞提供能量，并能将线粒体内产生的短链脂酰基输出，同时还有调节线粒体内乙酰CoA/CoA的比值、刺激肝脏生酮过程、促进蛋白质降解、抗氧化和刺激糖原异生等作用[1]。本品的补充可缓解其因体内缺乏引起的脂肪代谢紊乱、骨骼肌和心肌等组织的功能障碍。

左卡尼汀注射液商品名可益能(Carnitene)，由意大利Sigma-Tau公司研制，临床上主要用于改善慢性肾衰长期血透病人因继发性肉碱缺乏产生的一系列并发症状，临床表现如心肌病、骨骼肌病、心律失常、高脂血症，以及低血压和透析中肌痉挛等[2-3]。

《欧洲药典》(EP)8.0版左卡尼汀的质量标准中提到，左卡尼汀中可能存在4个有关物质，分别是杂质A：(E)-或-(Z)-4-(三甲基铵基)-2-烯-丁酸内盐、杂质B：(1RS，3SR)-1，2，2-三甲基-1，3-环戊烷-1，3-二羧酸、杂质 C：(2R)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-羟基)-丁基铵、杂质D：(E)-或-(Z)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-烯)-丁基铵。4个有关物质均为在左卡尼汀生产过程中产生的工艺杂质，其中杂质B为工艺中因存在拆分消旋体步骤而使用的拆分剂，目前左卡尼汀的生产大多以手性化合物为起始原料，不再使用该拆分剂，故本研究中未进行杂质B的合成研究。

4个有关物质的结构式见图1。

杂质A、杂质C和杂质D的合成方法均未见文献报道，只能从国外公司高价购买杂质对照品，大大增加了左卡尼汀的质量研究成本。本研究参考相关文献设计合成路线，并对杂质A、C、D进行了合成。其中杂质A的合成以左卡尼汀为原料[4]，在乙酸中以乙酸酐为脱水剂脱水制得；杂质C的合成以化合物1为原料[5-6]，经胺解开环、氰基取代、盐酸水解制得；杂质D的合成使用杂质A为原料[7-9]，在甲醇中与氯化亚砜反应制得相应的甲酯，然后氨解制得；杂质A、杂质C和杂质D的合成路线见图2。

1 仪器与试药

Varian INOVA-300核磁共振波谱仪(美国瓦里安技术有限公司)；Bruker amaZon X质谱仪(德国布鲁克公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；W2RS-2目视熔点仪(上海精科仪器有限公司)；左卡尼汀、(R)-环氧氯丙烷购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙酸、乙酸酐、氨水和氯化亚砜购于国药集团化学试剂北京有限公司，三甲胺盐酸盐购于Sigma-Aldrich试剂公司，盐酸购于莱阳市康德化工有限公司，杂质A对照品购于欧洲药品质量管理局，杂质C对照品购于加拿大TLC对照品公司。

2 方法与结果

2.1 (E)-4-(三甲基铵基)-2-烯-丁酸内盐(杂质A)的合成向配有磁力搅拌、温度计和球形冷凝管的250 mL三口反应瓶中加入左卡尼汀10 g(62 mmol)、乙酸100 mL和乙酸酐19 g(186 mmol)，搅拌下加热至回流，并搅拌回流24 h；反应结束后，将反应液55℃减压蒸干，向蒸馏剩余物中加入甲醇100 mL和活性炭2 g，搅拌下加热至回流，并回流1 h；过滤，滤液50℃减压蒸干；剩余物加入无水乙醇20 mL，加热溶解，然后冰浴降温至10℃左右搅拌析晶1 h，过滤，滤饼50℃真空烘干2 h，得到白色固体杂质 A(3.1 g，收率34.9%)，mp：182 ℃分解。含量95.3%[HPLC外标法(杂质A对照品购于欧洲药品质量管理局)：色谱柱以氨基键合硅胶为填充剂(3.9 mm×300 mm，10μm)；以磷酸二氢钾溶液(6.81 g·L-1的磷酸二氢钾溶液，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至4.7)-乙腈(35∶65)为流动相；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；检测波长205 nm]。 MS(m/z)：144.1[M+H]+；1H-NMR(CD3OD，300 MHz)δ：3.13(9H，s，-CH3)，4.03～4.06(2H，d，J＝7.5Hz，-CH2)，6.28～6.33(1H，d，J＝15.3 Hz，＝CH-C＝O)，6.48～6.59(1H，m，＝CH-)；13C-NMR(CD3OD，300 MHz)δ：52.1(3C)，66.6，125.8，140.6，171.7。

2.2 (S)-3-氯-2-羟基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氯化物(2)的合成 向配有磁力搅拌、温度计和恒压滴液漏斗的100 mL三口反应瓶中加入三甲胺盐酸盐12.4 g(130 mmol)和纯化水50 mL，搅拌，控制温度40℃以下滴加化合物1[(R)-环氧氯丙烷]10 g(108 mmol)，加完后控温40～45℃反应4 h；将反应液55℃减压蒸去水，并用无水乙醇 20 mL带水，得到化合物2的粗品；向所得的化合物2的粗品中加入甲醇30 mL，搅拌下加热至回流，固体全部溶解后，自然降至室温，然后用冷冻水降温至0～5℃析晶2 h，过滤，滤饼50℃鼓风烘干2 h，得到化合物2(13.3 g，收率65.5%)。

2.3 (R)-3-氰基-2-羟基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氯化物(3)的合成 向配有磁力搅拌、温度计的100 mL反应瓶中加入化合物2 13.0 g(69 mmol)和甲醇50 mL，搅拌下加热至50℃使化合物2完全溶解，分批加入氰化钠3.7 g(76 mmol)，加完后控温50～55℃反应6 h；将反应液降温至20～25℃，反应液过滤，滤液50℃减压蒸干，向蒸馏剩余物中加入无水乙醇50 mL，降温至0～5℃搅拌1 h，过滤，滤饼50℃鼓风烘干2 h，得到化合物 3(10.1 g，收率82.1%)。

2.4 (2R)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-羟基)-丁基铵氯化物(杂质C盐酸盐)的合成 向配有磁力搅拌和温度计的50 mL反应瓶中加入化合物3[(R)-3-氰基-2-羟基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氯化物]5 g(28 mmol)和浓盐酸12.5 mL(150 mmol)，控温20～25℃搅拌反应48 h；反应结束后，过滤，滤液55℃减压蒸干，剩余物加入90%乙醇100 mL，加热至70℃搅拌至溶解，搅拌下降温至10～20℃析晶2 h，过滤，滤饼50℃真空烘干4 h，得到白色固体杂质C盐酸盐(3.3 g，收率60.0%)，mp：214～216℃。 含量97.5%[HPLC 外标法(杂质C对照品购于加拿大TLC对照品公司)：色谱柱以氨基键合硅胶为填充剂(3.9 mm×300 mm，10μm)；以磷酸二氢钾溶液(6.81 g·L-1的磷酸二氢钾溶液，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节 pH值至4.7)-乙腈(35∶65)为流动相；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；检测波长 205 nm]。 MS(m/z)：161.1 M+；1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：2.24～2.30(2H，dd，J＝2.4，6.6 Hz，-CH2)，3.15(9H，s，-CH3)，3.34～3.36(2H，d，J＝5.7 Hz，N-CH2)，4.40～4.46(1H，m，-CH-)，5.74～5.76(1H，d，J＝5.7 Hz，-OH)，6.99、7.54(2H，s，-NH2)；13C-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：41.8，54.1(3C)，63.3，70.3，172.1。

2.5 (E)-N，N，N-三甲基-(4-氨基-4-氧代-2-烯)-丁基铵(杂质D)的合成 向配有磁力搅拌、温度计和恒压滴液漏斗的100 mL反应瓶中加入杂质A 2 g(14 mmol)、甲醇20 mL，搅拌降温至10℃以下，控温10℃以下滴加氯化亚砜8.3 g(70 mmol)，然后升温至20～25℃反应20 h，反应结束后，将反应液40℃减压蒸干，剩余物加入氨水4.5 mL，20～25℃搅拌4 h，反应结束后，反应液50℃减压蒸干，所得油状物通过柱色谱[洗脱剂：二氯甲烷：甲醇(5∶1)]纯化，得到类白色固体，即为杂质 D(1.2 g，收率60.0%)，mp：191 ℃分解。 纯度99.6%[HPLC面积归一化法：色谱柱以氨基键合硅胶为填充剂(3.9 mm×300 mm，10μm)；以磷酸二氢钾溶液(6.81 g·L-1的磷酸二氢钾溶液，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至4.7)-乙腈(35∶65)为流动相；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；检测波长205 nm]。 MS(m/z)：143.1 M+；1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：3.11(9H，s，-CH3)，4.18～4.21(2H，d，J＝7.5Hz，-CH2)，6.29～6.34(1H，d，J＝15Hz，＝CH-C＝O)，6.68～6.78(1H，m，＝CH-)，7.32，8.03(2H，s，-NH2)；13C-NMR(DMSO-d6，300 MHz) δ：52.8(3C)，65.7，129.1，135.4，166.0。

3 讨论

3.1 本文报道了左卡尼汀中主要存在的3个杂质的合成方法。杂质A有E构型和Z构型两种构型的异构体，其中E构型比较稳定，在反应得到的粗品中占约90%以上，通过无水乙醇重结晶，可以将Z构型杂质A完全去除，得到E构型的杂质A，并通过高效液相色谱和核磁共振氢谱的检测结果，确认了得到的杂质A为E构型。杂质C合成的关键步骤是化合物3的氰基在盐酸中水解步骤，氰基在盐酸中先水解为酰胺，酰胺继续水解为酸；在试验中发现反应温度高会造成副产物(酸)的比例增多，造成产品的含量降低，所以在杂质C的制备中，需要严格控制盐酸水解步骤的反应温度为20～25℃，以减少副产物的生成。杂质D同杂质A一样，有E构型和Z构型两种异构体，本研究使用E构型的杂质A来制备杂质D，得到E构型的杂质D。

3.2 目前没有文献报道左卡尼汀杂质A、杂质C和杂质D的合成方法，而在左卡尼汀的质量研究和稳定性考查过程中，需要用到上述3个杂质的对照品，只能从国外高价购买，造成研究费用明显增加。本文研究并合成了上述3个杂质，各杂质含量或纯度均在95%以上，可以作为杂质对照品使用，同时各杂质合成所使用的试剂价格低廉，杂质的合成成本较低，有效降低了左卡尼汀的研发成本。