信号转导与转录激活子1对高迁移率族蛋白1启动子转录的调控作用

姚雯菲，许立新

(广州医科大学附属市一医院，广东 广州 510000)

脓毒症是宿主对感染反应失调而导致危及生命的器官功能障碍[1]，临床致死率超过20%[2]，各种抑制早期炎症的手段效果不明显。1999年，Wang等[3]在脓毒症动物模型中发现了一种晚期炎症介质高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)，既可诱导免疫细胞释放炎症因子，自身也作为晚期炎症介质参与炎症级联反应[4]。有研究结果显示，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)可通过Janus激酶/信号转导与转录激活子(the janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信号通路诱导巨噬细胞HMGB1转录，且促进HMGB1乙酰化和核易位[5-6]。我们猜测脓毒症的关键分子STAT1可能作为一个转录因子启动HMGB1基因的转录。但是STAT1如何调控HMGB1的转录过程目前尚不清楚，为了验证此问题，我们利用生物信息学网站预测发现，小鼠HMGB1基因启动子上含有多个STAT1的结合元件；本研究使用siRNA抑制STAT1表达，探讨STAT1对HMGB1 转录水平的影响；构建小鼠HMGB1基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒，将上述荧光素酶报告质粒分别与pcDNA3.1-STAT1质粒共转染293T细胞，探讨STAT1对HMGB1基因启动子活性影响的区域；利用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验分析STAT1与HMGB1启动子的结合情况，为今后深入研究脓毒症HMGB1基因提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人肾上皮细胞株293T为广州市第一人民医院麻醉学实验室保存。高纯总RNA快速提取试剂盒，实时荧光定量PCR检测试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。荧光素酶双报告载体质粒(pGL3-Basic和pRL-SV40)及双荧光素酶报告基因检测试剂盒，染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒购自美国Promega公司。转染试剂LipofectamineTM2000、PCR引物购自美国Invitrogen公司。限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ、T4 DNA连接酶、DMEM培养基购自美国Thermo公司。RAW264.7-pcDNA3、RAW264.7-siRNA-STAT1-1、RAW264.7-siRNA-STAT1-2细胞株、siRNA-STAT1-1质粒、siRNA-STAT1-2质粒、pGL3-basic质粒、pcDNA3.1质粒、pcDNA3.1-STAT1质粒由广州辉园苑医药科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1实时荧光定量检测HMGB1 mRNA 小鼠细胞株RAW264.7、RAW264.7-pcDNA3、RAW264.7-siRNA-STAT1-1、RAW264.7-siRNA-STAT1-2分别培养在含DMEM培养液中，培养条件为37 ℃，5%CO2。采用Trizol法提取各细胞的总RNA，完成后使用cDNA合成试剂盒，将上述RNA反转录成cDNA。然后制备qPCR反应体系：cDNA 1 μL，SYBR 10 μL，上下游引物各0.5 μL，补充ddH2O至总体积20 μL，离心使反应液充分混匀。以Actb为内参，上游引物序列5’-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3’，下游引物序列5’-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3’；HMGB1上游引物序列5’-GCTAGTCTTTTGCTTTGCCCA-3’，下游引物序列5’-TGATCACTCCTTGCTTTGCC-3’。qPCR扩增条件：94 ℃预变性1 min，94℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循环40次。使用2-△△Ct的计算方法计算HMGB1 基因的表达量。

1.2.2设计小鼠HMGB1基因启动子(全长和各截短)引物序列并扩增 在基因库数据库中，搜索小鼠HMGB1 DNA序列( GenBank_ID：15289)，寻找该基因的转录起始位点ATG，由此向上游确定一段序列。利用Primer 5.0软件辅助设计HMGB1基因启动子区(-1700～+100bp)的引物，应用生物信息学网站PROMO2.0和LASAGNA-Search 2.0预测HMGB1基因启动子STAT1可能的结合元件，根据预测结果和以不中断转录调控元件为原则设计引物并扩增启动子各截短片段。引物序列见表1，其中下划线分别代表KpnⅠ and HindⅢ酶切位点。以小鼠基因组DNA为模板，PCR扩增小鼠HMGB1基因启动子序列(全长和各截短)。PCR扩增条件，94℃预变性5 min，95℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次后，75℃终延伸5 min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后进行割胶纯化。

1.2.3构建与鉴定小鼠HMGB1基因启动子全长和截短质粒 用限制性内切酶KpnⅠ和 HindⅢ 双酶切pGL3-basic以及上述PCR产物，回收目的片段。将上述两种回收产物用重组酶连接，将连接产物转化到感受态细胞DH5α中进行PCR扩增，根据PCR结果筛选出阳性克隆质粒，再送广州辉园苑医药科技有限公司测序鉴定。鉴定正确后，将构建的质粒分别命名为pGL3-HMGB1-P1800、pGL3-HMGB1-P1300、pGL3-HMGB1-P800、 pGL3-HMGB1-P400，以下简称为P1800、P1300、P800、P400。

表1 扩增小鼠HMGB1基因启动子 (全长和截短)引物序列

1.2.4细胞转染 将293T细胞接种于24孔板(1×105个/孔)，培养过夜，待细胞融合度达到70%时，用转染试剂将(STAT1)分别与上述HMGB1启动子全长和各截短质粒共转染293T细胞，其中各组均共转染pRL-TK作为转染率内参照(10∶10∶1)，实验同时设转染pGL3空质粒(pGL3-basic)组作为对照。

1.2.5测定荧光素酶的活性 质粒转染293T细胞后48 h，PBS轻柔洗涤2次，加入裂解液裂解细胞，收集裂解物于管中。用双荧光素酶报告基因测试剂盒，分别对HMGB1基因启动子全长和各截短表达质粒和内参照质粒的荧光素酶活性进行测定，具体操作详见试剂说明书。测定目的基因的萤火虫荧光素酶活性(标记M1)，内参pRL-TK质粒的海肾荧光素酶活性(标记为M2)，被测质粒的相对荧光素酶活性(relative luciferase activity，RLU)即M1/M2。每组实验重复3次，结果取平均值。

1.2.6染色质免疫共沉淀 培养293T细胞株，待细胞生长覆盖率为 80%～90%时，冰PBS洗3次，用1%甲醛交联10 min，加甘氨酸中和甲醛，冰PBS重复洗3次。37 ℃孵育 20 min。超声破碎细胞后离心，取上清并分为实验组与阴性对照组。实验组加入Anti-STAT1抗体，阴性对照组加入非特异性IgG，4 ℃孵育过夜，待抗体与STAT1-DNA 复合物相互结合后，加入ProteinG 磁珠，沉淀抗体STAT1-DNA 复合物，并对沉淀下来的复合物进行清洗。洗脱，得到可能富集STAT1-DNA 的复合物，解交联，用 DNA 纯化柱纯化并富集被沉淀下来的 DNA 片段，对HMGB1启动子DNA 进行PCR 分析。应用HMGB1基因启动子-1700～-700bp特异性引物：上游引物序列5’-GCTAGTCTTTTGCTTTGCCCA-3’，下游引物序列5’-TGATCACTCCTTGCTTTGCC-3’。SYBR green染色方法进行PCR扩增。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 抑制STAT1表达对HMGB1 mRNA的影响

qPCR法鉴定空载组NC、抑制组siRNA-STAT1、抑制组siRNA-STAT2细胞株中HMGB1的mRNA的表达量。图1显示，与NC比较， siRNA-STAT1-1、siRNA-STAT1-2细胞中HMGB1的mRNA表达量明显降低(P<0.05)。表明抑制STAT1表达能抑制HMGB1 mRNA的表达量，即STAT1能上调HMGB1的转录水平。

2.2 小鼠HMGB1基因启动子全长及各截短质粒的构建与鉴定

2.2.1小鼠HMGB1基因启动子截短位置的确定 应用生物信息学网站PROMOTER2.0和LASAGNA-Search 2.0进行预测。结果表明，在HMGB1启动子区域共含有7个可能的STAT1结合元件，具体序列和位置见表2。据此设计了3对引物以及扩增HMGB1基因启动子各截短序列，引物序列见表1。设计的HMGB1基因启动子全长和各截短的长度分别为1800bp(-1700～+100bp)、1300bp(-1200～+100 bp)、800bp(-700～+100 bp)、400bp(-300～+100 bp)。

注：与NC组比较，*P<0.05

图1 siRNA-STAT1对HMGB1 mRNA转录水平的影响

表2 小鼠HMG1 启动子区 STAT1的结合元件预测

2.2.2小鼠HMGB1基因启动子全长及各截短质粒的构建与鉴定 根据小鼠HMGB1基因启动子全长和各截短引物，以小鼠基因组DNA为模板，用PCR扩增HMGB1基因启动子全长及各截短片段，扩增结果见图2。将扩增回收产物插入pGL3-basic质粒中。重组质粒经转化涂板以及挑单克隆摇菌后，进行菌液PCR反应，筛选出阳性克隆(图3)，送测序。与小鼠HMGB1启动子序列比对，显示序列及插入方向正确。上述结果显示小鼠HMGB1基因启动子全长和各截短荧光素酶报告质粒构建成功，可用于后续研究。

图2 PCR扩增HMGB1基因启动子全长及各截短片段结果 M为Marker 1为扩增产物

图3 HMGB1全长及各截短质粒双酶切结果 M为Marker 1为pGL3质粒 2为双酶切结果

2.3 STAT1对小鼠HMGB1基因启动子全长和截短活性的影响

将pGL3-Basic、HMGB1基因启动子全长P1800和各截短P1300、P800、P400荧光素酶报告质粒分别与pcDNA3.1-STAT1共转染293T细胞，检测各组荧光素酶活性。由图4可见，与空载体组相比，全长启动子P1800和截短启动子P1300荧光强度显著增加(P<0.05)；与空载体组相比，截短启动子P800和截短启动子P400荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。说明STAT1能显著提高HMGB1基因启动子-1700～-700 bp之间的荧光素酶活性，STAT1可能与HMGB1基因启动子-1700～-700bp区域结合，发挥调控HMGB1转录调控的作用。HMGB1启动子-700～+100 bp之间的荧光素酶活性与空载体比较，无统计学意义(P>0.05)，即在STAT1可能没有在此区域与HMGB1启动子结合调控其活性。

2.4 染色质免疫共沉淀

加入STAT1抗体 的Anti-STAT1组的 HMGB1表达量较 IgG阴性对照组明显升高(P<0.05)，见图5。根据2.3实验结果可知，STAT1可能与HMGB1启动子-1700～-700bp区域结合，据小鼠HMGB1基因启动子-1700～-700bp序列设计PCR引物，Input对照以没有进行免疫沉淀反应的DNA为模板，阴性对照以鼠IgG抗体免疫沉淀的DNA为模板，STAT1抗体免疫沉淀的DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的扩增条带，结果如图6所示，Input对照和Anti-STAT1的实验组有目的扩增条带，阴性对照未检测到目的扩增条件。进一步验证STAT1可与HMGB1基因启动子-1700～-700bp区域DNA序列直接结合。

注：与空载体组比较，*P<0.05

图4 HMGB1基因启动子全长和各截短荧光素酶活性

注：与IgG阴性对照组比较，*P<0.05

图5 STAT1与HMGB1启动子结合的染色质免疫共沉淀验证结果

图6 染色质免疫共沉淀-PCR检测HMGB1启动子结果

3 讨论

脓毒症的发病机制是炎症因子释放的级联反应，HMGB1作为重要的晚期炎症介质，一方面通过自身的毒性作用，另一方面和炎症因子相互作用放大炎症反应，使脓毒症进一步加重。脓毒症患者血浆中的HMGB1浓度高于正常者，且与病情严重程度呈正相关[7]。因此减少或抑制HMGB1的转录表达和释放，可能有利于治疗脓毒症。

在脓毒性休克小鼠中，STAT1基因敲除鼠存活率明显高于野生组鼠，这说明STAT1在脓毒症中发挥重要作用[8]。大量研究结果显示，在脓毒症中JAK/STAT信号通路对激活HMGB1转录起关键作用[9,10]，此外，SIRT1/STAT信号通路对HMGB1转录、表达和释放也有促进影响[11]。因此，本实验重点研究STAT1对HMGB1启动子的转录调控作用。首先利用siRNA抑制STAT1表达后，发现HMGB1 转录水平明显下降；为进一步探讨STAT1对HMGB1启动子作用的区域，我们利用生物信息学网站预测结合位点，以不中断转录调控元件为原则，筛选STAT1与HMGB1的结合区域，设计构建了HMGB1基因启动子全长及各截短荧光素酶报告质粒，将上述质粒分别与STAT1重组质粒共转染293T细胞。本研究结果表明，P1800和P1300启动子荧光素酶活性显著高于空载体组，提示STAT1可能与HMGB1启动子上-1700～-700bp区域结合，从而提高启动子的活性；而P800和P400组与空载体组无明显差异，提示在HMGB1启动子-800～+100bp区域，STAT1没有发挥调控启动子活性的作用，推测STAT1在此区域没有和HMGB1启动子结合。染色质免疫共沉淀实验进一步验证，STAT1能与HMGB1启动子-1700～-700bp区域直接结合。不过，STAT1与HMGB1具体的结合元件须通过启动子突变实验才能准确定位。另外，目前并不清楚在脓毒症中，除了STAT1之外，是否存在其他转录因子直接参与调节HMGB1的表达，这值得进一步探究。

综上所述，本研究初步证实了STAT1能通过与HMGB1基因的启动子-1700～-700bp区域直接结合从而上调其转录水平。