血必净注射液对ANP大鼠肠道菌群及肠黏膜屏障功能的影响

黄耀星 严清青 苏 伟 何梓健 罗键雄 李伟冬 赵寒冰 贾 林

广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院(广州 510180)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) 是一种严重的全身性疾病，肠道黏膜屏障损伤导致肠道细菌移位可造成对胰腺的“二次打击”，诱发和加重全身炎症反应综合征(systematic inflammation response syndrome, SIRS)、多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，增加死亡风险[1]。以往由于检测方法限制，对肠道生物屏障研究具有一定的局限性，16SrRNA高通量测序法灵敏度高，可较全面地检测菌群的丰度、种类以及分布特点，有助于研究AP重症化与肠道菌群失衡之间的关系。

保护肠道功能可改善SAP患者预后及缩短病程，但目前肠内营养、预防性使用抗生素、补充益生菌等治疗手段仍存在争议。祖国医学对肠道功能障碍的认识和研究历史悠久，强调整体观念、辩证施治，效果良好。课题组前期研究结果显示[2]，血必净注射液可抑制SAP大鼠炎症介质、二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸释放，对肠黏膜损伤具有保护作用，然而对肠道菌群及生物屏障的作用和机制仍有待进一步研究。本研究通过建立急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠模型，阐述血必净注射液对炎症介质、肠黏膜机械和生物屏障及菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂材料

SPF级成年SD大鼠(南方医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK(粤)2016- 0041)；血必净注射液(天津红日药业有限公司，国药准字Z2000403)；牛黄胆酸钠(美国Sigma公司)；大鼠amylase、CRP、TNF-α、IL- 6、IL-1β、LPS、D-乳酸及DAO的ELISA试剂盒(Elabscience公司)；Trizol试剂盒(Invitrongen公司)；PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq II(TAKARA公司)；粪便细菌基因组DNA提取试剂盒(华大基因有限公司)。

1.2 动物分组和模型制备

40只SD大鼠按数字随机法分为空白组(n=10)、假手术组(n=10)、ANP组(n=10)和治疗组(n=10)，体质量220～250 g。ANP组和治疗组均采用经胆胰管逆行注射4.5%牛黄胆酸钠溶液(1 mg/kg)的方法制备ANP模型[3]，治疗组造模3 h后经鼠尾静脉注射血必净注射液(3 mL/kg)，ANP组则注射等量生理盐水；假手术组仅翻动胰腺、胃肠等器官后关腹。造模后24 h处死大鼠，收集结肠粪便、心脏采血、取回肠末段及胰腺组织。所有大鼠均遵循实验动物伦理学要求进行饲养及实验操作。

1.3 血清淀粉酶、炎症因子、D-乳酸及DAO的检测

血液标本经低速离心后取上清，按酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒上说明，检测血淀粉酶、CRP、TNF-α、IL- 6、IL-1β、LPS、D-乳酸及DAO的水平。

1.4 粪便样本获取与测序

大鼠麻醉后取仰卧位解剖，剪取结肠末端直至盲肠段，用灭菌镊子将结肠段内粪便取下(不少于3粒)，置于1.5 mL EP管中，冻存于- 80℃冰箱。大鼠粪便16SrRNA Illumina高通量测序送至华大基因有限公司进行测定，实验流程：DNA提取、设计合成、引物接头、PCR扩增、产物纯化、PCR产品定量和均一化、Miseq文库构建、测序均按照试剂盒说明操作。根据各细菌的16SrRNA基因序列设计特异性PCR引物，采用RT-PCR方法检测粪便乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、大肠杆菌、普拉梭菌的细菌数量。Shannon指数和Simpson指数为物种多样性指标，Shannon指数越大Simpson指数越小，代表物种越丰富。

1.5 组织病理

4%多聚甲醛固定胰腺及回肠末段组织，常规脱水、石蜡包埋、切片后行HE染色，由两位病理医师阅片，胰腺病理评分采用Schemidt标准[4]，小肠组织病理评分采用Chiu’S分级[5]。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 一般情况

空白组大鼠体质量(246.9±14.1)g，假手术组大鼠体质量(248.4±12.2)g， ANP组大鼠体质量(249.4±12.9)g，治疗组大鼠体质量(247.6±9.8)g，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。空白组、假手术组造模24 h内无死亡；ANP组大鼠腹胀、反应迟钝，造模24 h内死亡2只；治疗组大鼠有腹胀，反应较迟钝，多数排稀烂便，造模24 h内死亡1只。

2.2 血淀粉酶、炎症介质、内毒素水平

经检验CRP、TNF-平、LPS满足方差齐性，采用单因素方差分析，AMS、IL- 6、IL-1差方差不齐，采用Kruskal-Wallis检验；结果示ANP组和治疗组血清AMS、CRP、LPS、TNF-α、IL- 6和IL-1β的水平高于空白组和假手术组(P<0.05)；血必净治疗组血清AMS、CRP、LPS、TNF-α、IL- 6和IL-1β水平低于ANP组(P<0.05)。见表1。

表1 各组的血清炎症因子水平

图1 各组粪菌α多样性、Shannon指数、Simpson指数

2.3 肠道菌群多样性、丰度差异及菌群结构的组成

粪便菌群经16SrRNA高通量测序，见图1 α多样性分析、shannon指数和simpson指数所示，ANP组粪菌的丰富度和多样性少于空白组和假手术组，血必净治疗组可改善ANP大鼠粪菌的丰富度和多样性。图2 β多样性分析结果显示，与空白组、假手术相比，ANP组粪菌群种类差异明显，血必净治疗可缩小粪便菌群种类与空白组、假手术组的差异。图3、4结果显示，各组粪菌分类比较，ANP组厚壁菌门细菌量减少，血必净治疗可提高厚壁菌门菌量；Lefse结果显示ANP组以变形菌门为主，治疗组则以脱铁杆菌为主。

图2 各组粪菌β多样性分析

图3 各组粪便细菌门水平分布 图4 Lefse分析

经检验各组粪菌数量满足方差齐性，采用单因素方差分析；ANP组粪便中有益菌(乳酸杆菌、双歧杆菌、普拉梭菌)数量低于空白组和假手术组，而致病菌(肠球菌、大肠埃希菌)增多；血必净治疗可提高ANP大鼠粪便有益菌数量，降低致病菌数量，上述差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠粪便细菌量的比较

2.4 肠黏膜屏障功能及病理评分

经检验，各组数据均方差不齐，采用Kruskal-Wallis检验；ANP组和治疗组血清D-乳酸和DAO的水平高于空白组和假手术组(P<0.05)；血必净治疗组血清D-乳酸和DAO水平低于ANP组(P<0.05)。

空白组、假手术组胰腺组织无改变，ANP组胰腺组织炎症有改变，治疗组胰腺组织炎症略轻于ANP组，病理评分差异有统计学意义(P<0.01)，提示ANP大鼠建模成功；空白组和手术组小肠组织无改变，ANP组小肠黏膜结构不完整，绒毛上皮水肿及局部脱落、溃疡形成，固有层毛细血管及淋巴管扩张，炎性细胞浸润；治疗组病理改变介于空白组与ANP组之间，病理评分差异有统计学意义(P<0.01)(表3，图5)。

表3 各组大鼠的肠黏膜屏障功能和组织病理评分

图5 各组大鼠的小肠病理图(HE染色法，50病)注：图A：空白组，图B：假手术组，图C：ANP组，图D：治疗组

3 讨 论

肠道屏障功能障碍在SAP中十分常见，是诱发和加重SIRS和MODS的关键，与疾病后期肠道细菌移位引起胰腺感染坏死，增加SAP患者死亡率息息相关[6]。肠黏膜屏障包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障及生物屏障，其损伤确切机制尚不明确。与机械、化学屏障相比，生物屏障受限于传统检测手段，以往研究报道更不多。随着16SrRNA高通量测序技术发展，国内外研究逐渐认识到以肠道菌群为主的生物屏障在维持肠道免疫稳态中发挥重要作用。

寄居在人类肠道内的肠道菌群种类超过1 000种，数量高达100万亿，其中以专性厌氧菌为主，它们通过特异性抗原-抗体结合的方式定植于肠黏膜上皮表面并被粘液包裹形成菌膜，阻止条件致病菌作用于肠上皮细胞，能通过酵解作用为肠黏膜提供成分，促进上皮修复，与宿主微空间结构形成了一个相互依赖又相互作用的微生态系统[7- 8]。2015年Tan等研究发现，与健康人群相比，AP患者肠道菌群的多样性明显降低，肠道微生态失衡早在SIRS或MODS发生前已存在；对SAP患者的亚组分析显示，肠道微生态失衡与MODS、二重感染发生密切相关，肠杆菌、肠球菌等有害菌数量与IL-1、IL- 6、TNF-α等炎症因子水平呈正相关，肠道菌群的变化可导致肠屏障损害和诱导相关细菌易位[9- 10]。2019年Zhu[11]等对AP患者和动物模型研究报道，肠道菌群失衡与SIRS和肠黏膜屏障功能障碍显著相关，移植AP粪菌的无菌小鼠较移植正常粪便对照组胰腺损伤更严重，证实肠道菌群失衡可影响AP重症化，均提示肠道菌群失衡在AP发展中并不单纯是“受害者”，反而更像是“扳机”在免疫炎症反应中起促发作用。

维持肠屏障功能的稳定是SAP治疗重点，在一定程度上能缩短病程及改善预后。然而包括预防性使用抗生素、肠道去污、早期肠内营养和补充益生菌等多种疗法的效果仍存在争议，Besselink发现预防性应用益生菌反而增加SAP患者的死亡风险[12]，粪菌移植技术(FMT)在AP临床治疗未有报道。祖国医学对胰腺炎和肠道功能障碍的认识和研究历史悠久，认为SAP病机是以瘀血热毒互结为本。血必净注射液是王今达教授以古方血府逐瘀为基础精炼制成的中药复方静脉制剂，理论基础是“菌(细菌)、毒(内毒素)、炎(炎症)并治”，其主要成分为赤芍、川芎、丹参、红花、当归等[13]。血必净注射液在脓毒血症和SAP患者的临床应用中，具有拮抗细菌、下调内毒素水平、调节炎性介质的合成与释放、减少氧自由基总量、调节免疫功能、改善微循环、保护内皮细胞作用[14- 15]。

课题组前期的实验结果也发现，血必净注射液能降低ANP大鼠血清淀粉酶、TNF-α、内毒素，下调肠黏膜Toll样受体4和9的表达，抑制NF-κB的活性，下调促炎细胞因子的水平，降低DAO和D-乳酸水平，保护SAP大鼠肠黏膜屏障功能[2,16- 17]，但血必净注射液对ANP肠道生物屏障和肠道菌群的影响尚未见报道。本研究中，从动物模型胰腺和小肠组织的病理评分可知，ANP组大鼠肠道黏膜屏障发生严重的破坏，DAO和D-乳酸水平升高，血清内毒素增加，16SrRNA高通量测序显示粪菌的多样性降低，与空白组、假手术的菌种种类差异明显，厚壁菌门细菌明显减少，说明ANP大鼠建模成功，存在明显的肠黏膜屏障功能障碍。治疗组给予血必净注射液后，大鼠的小肠黏膜病理受损程度较ANP组减轻，血清内毒素、DAO和D-乳酸水平降低，高通量测序显示粪菌的多样性较ANP组改善，菌种种类与空白组、假手术差距缩小，厚壁菌门细菌数量较ANP组提高；进一步分析有益菌和致病菌的构成发现，治疗组乳酸杆菌、双歧杆菌和普拉梭菌等有益菌数量显著高于ANP组，肠球菌和大肠埃希菌等致病菌比例显著低于ANP组。普拉梭菌属于厚壁菌门梭菌纲，可以调控TNF-α等细胞因子分泌抗炎，其产物丁酸还可以为肠黏膜提供能量；双歧杆菌和乳酸杆菌属于大家熟知的厌氧益生菌群。而大肠埃希菌为主的需要条件致病菌优势生长，使得肠道厌氧菌生长受抑，进而引起SAP肠源性细菌感染已在实验中模拟证实[18]。

本研究ANP模型肠道菌群和黏膜屏障功能与国内外研究结果相似，并进一步发现血必净注射液可从微生态上增加ANP大鼠的肠道菌群多样性和丰富性，增加益生菌的含量，降低有害菌群的定植能力，减少体内内毒素和促炎因子的水平，改善肠黏膜屏障功能，起到对肠道的保护作用。但肠道微生态门纲目科属种的分类众多，哪些细菌在肠道菌群失衡中发挥关键作用，其代谢产物是否参与AP的进展，仍需要进一步更全面、深入的研究。