microRNA- 29a- 3p对白介素- 22诱导的HaCaT细胞增殖的影响研究

李璟蓉 思 远 赵 瑞 吴 江 方锐华

广州市第一人民医院皮肤科，华南理工大学附属第二医院皮肤科 (广州 510180)

银屑病是由多种因素作用引起的慢性鳞屑性皮肤病，具有病程迁延不愈和容易反复发作的特点，严重影响病人及其家属的生活质量[1]。目前，银屑病的发病机制尚不明确，但越来越多的研究表明银屑病属于免疫介导的多基因遗传性皮肤病[1]。银屑病以角质形成细胞过度异常增生为主要特征[2]。研究发现，可介导免疫调节的炎症性因子白介素22(IL- 22)可以诱发人表皮角质形成细胞的增殖，抑制其凋亡，从而促进银屑病的发生和发展[3- 4]。因此，探寻可以有效抑制IL- 22作用的分子机制将有助于进一步揭示银屑病的发病机制，为银屑病治疗靶向药物的研发提供新的分子靶点。

microRNAs (miRNAs)是一类长度约为21～23个核苷酸的非编码单链RNA分子[5]。近年来，miRNAs在银屑病发生和发展中的重要作用逐渐被揭示[6]。血清miR- 29a- 3p(也称为miR- 29a)在自身免疫性疾病如硬皮病和类风湿性关节炎病人的血清中显著降低，且miR- 29a- 3p通过抑制STAT3抑制类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和诱导细胞凋亡[7- 8]。鉴于miR- 29a- 3p在自身免疫性疾病中的重要作用，我们推测miR- 29a- 3p可能在调控银屑病的发生发展方面也发挥重要的作用。因此，本文将研究miR- 29a- 3p对IL- 22诱导的HaCaT细胞增殖及凋亡的影响，初步探讨其在银屑病发生发展中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

人永生化表皮细胞HaCaT来自上海中国科学院上海细胞库；Minimum Essential Medium培养基和胎牛血清产自美国Hyclone；IL- 22产自美国PeproTech；CCK8试剂盒产自日本同仁化学研究所；miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit、SanPrep Column microRNA Extraction Kit和MicroRNAs qPCR Kit (SYBR Green Method)产自上海生工；miR- 29a- 3p mimic合成自上海吉玛；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit产自美国BD Biosciences；Lipofectamine 2000产自美国invitrogen；细胞周期试剂盒产自上海碧云天。

1.2 细胞培养及分组

HaCaT细胞的培养基为Minimum Essential Medium加10%胎牛血清，置于条件为37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。扩大培养后，使用不同浓度的IL- 22(0 μg/L，25 μg/L，50 μg/L，100 μg/L)处理细胞24 h和48 h和72 h，CCK8检测细胞的活力。根据CCK8结果选择50 μg/L和100 μg/L的IL- 22的处理HaCaT细胞24 h，收集细胞荧光定量PCR检测miR- 29a- 3p的表达量。根据荧光定量PCR的结果，选择50 μg/L作为后续实验IL- 22的处理浓度，按照以下条件处理细胞，进行分组处理：

Cell组：按照转染的步骤添加Lipofectamine 2000 到HaCaT培养基中，常规培养HaCaT细胞。

IL- 22组：按照转染的步骤添加Lipofectamine 2000 到HaCaT培养基中，24 h后，使用50 μg/L IL- 22处理HaCaT细胞。

IL- 22+NC组：使用Lipofectamine 2000转染阴性对照(NC)microRNA mimic，转染24 h后，使用50 μg/L IL- 22处理HaCaT细胞。

IL- 22+ miR- 29a- 3p组：使用Lipofectamine 2000转染miR- 29a- 3p mimic，预转染24 h后，使用50 μg/L IL- 22处理HaCaT细胞。

1.3 细胞增殖实验

将HaCaT细胞接种在96孔板中，按照以上分组条件处理细胞，分别于IL- 22处理后24、48、72 h，向每孔添加10 μL CCK8溶液，培养箱内孵育4 h。Varioskan Flash 全波长多功能酶标仪检测450 nm处的吸光值。按照如下公式计算各组细胞的增值率：增殖率=(实验组吸光值-对照组吸光值)/对照组吸光值×100%。

1.4 荧光定量PCR

将HaCaT细胞接种在6孔板中，按照以上分组条件处理细胞，于IL- 22处理后24 h，收集细胞。按照SanPrep Column microRNA Extraction Kit的说明书提取miRNAs。按照miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit的说明书进行加尾法的逆转录。根据MicroRNAs qPCR Kit (SYBR Green Method)的说明书配置PCR体系，置于BIO-rad CFX96荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应。miR- 29a- 3p正向引物序列如下：5′-CGGTAGCACCATCTGAAAT-CGGTTA-3′，miR- 29a- 3p反向引物及内参引物由试剂盒提供。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡及周期

将HaCaT细胞接种在12孔板中，按照以上分组条件处理细胞，于IL- 22处理后48 h，收集细胞，按照FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit和细胞周期试剂盒的说明，处理细胞。ACEA NovoCyte流式细胞仪检测。NovoExpress软件分析各组细胞的凋亡和周期分步情况。

1.6 统计分析

2 结 果

2.1 IL- 22处理对miR- 29a- 3p表达的影响

见表1，与0 μg/L组相比，25 μg/L组、50 μg/L组和100 μg/L组HaCaT细胞的增殖率在24 h、48 h和72 h均出现升高(F值分别为33.27、36.19、52.29，均P<0.000 1)。

根据表1的结果，使用0 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的IL- 22的处理HaCaT细胞，荧光定量PCR检测miR- 29a- 3p的表达量，组间miR- 29a- 3p的表达量差异有统计学意义(F=129，P<0.000 1)。与0 μg/L组相比，miR- 29a- 3p在50 μg/L组和100 μg/L组HaCaT中的表达水平降低(均P=0.000 1)，分别降低83%和80%。因此，选择50 μg/L作为后续实验IL- 22的处理浓度。

表1 IL- 22处理24 h、48 h和72 h对HaCaT细胞增殖率的影响

*与0 μg/L组比较P<0.05。

2.2 过表达miR- 29a- 3p对IL- 22处理的HaCaT细胞增殖的影响

Cell组、IL- 22组、IL- 22+NC组与IL- 22+ miR- 29a- 3p组各组间miR- 29a- 3p的表达量差异有统计学意义(F=12.31，P=0.002 3)。与IL- 22+NC组相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p组miR- 29a- 3p的表达量增加(P=0.002 8)，miR- 29a- 3p在HaCaT细胞中已成功过表达。

Cell组、IL- 22组、IL- 22+NC组与IL- 22+ miR- 29a- 3p组各组间的增殖率在24 h、48 h和72 h差异有统计学意义(24 h：F=31.35，P<0.000 1；48 h：F=44.79，P<0.000 1；72 h：F=14.1，P=0.001 5)。统计结果见表2所示。与Cell组相比，IL- 22组的增殖率在24 h、48 h和72 h 均增高(P值分别为0.000 1、0.000 1、0.002 3)。与IL- 22+NC组相比，IL- 22+miR- 29a- 3p组的增殖率在24 h、48 h和72 h均降低(P值分别为0.002 1、0.001 6、0.023 1)。

表2 过表达miR- 29a- 3p对IL- 22处理的HaCaT细胞增殖的影响

*与Cell组比较P<0.05；#与IL- 22+NC组比较P<0.05。

2.3 过表达miR- 29a- 3p对IL- 22处理的HaCaT细胞凋亡的影响

Cell组、IL- 22组、IL- 22+NC组与IL- 22+ miR- 29a- 3p组各组间HaCaT细胞总凋亡率差异有统计学意义(F=275.3，P<0.000 1)。见图1。与Cell组相比，IL- 22组的细胞总凋亡率降低(11.17±0.75 vs 5.88±0.84，P=0.001 7)。与IL- 22+NC组相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p组的细胞总凋亡率增加(6.67±1.06 vs 30.55±1.86，P=0.000 1)。

2.4 过表达miR- 29a- 3p对IL- 22处理的HaCaT细胞周期的影响

Cell组、IL- 22组、IL- 22+NC组与IL- 22+ miR- 29a- 3p组各组间G1期和S期HaCaT细胞比例有差异(G1期：F=166.5，P<0.000 1；S期：F=116.6，P<0.000 1)，各组细胞G2期HaCaT细胞比例差异无统计学意义(F=1.574，P=0.269 9)。统计结果见表3，代表图见图2。与Cell组相比，IL- 22组G1期HaCaT细胞比例降低(P=0.000 1)，S期HaCaT细胞比例升高(P=0.000 1)。与IL- 22+NC组相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p组G1期HaCaT细胞比例增加(P=0.000 1)，S期HaCaT细胞比例降低(P=0.000 1)。

图1

表3 过表达miR- 29a- 3p对IL- 22处理的HaCaT细胞周期的影响

*与Cell组比较P<0.05；#与IL- 22+NC组比较P<0.05。

图2 各组细胞周期代表图

3 讨 论

银屑病是成人最常见的皮肤病，全世界1%～3%的人口受其影响。银屑病最常见的类型是寻常型银屑病，临床表现为红斑。银屑病的主要特点之一是角质形成细胞的异常增殖和分化异常[2]。研究发现，细胞免疫尤其是T细胞激活及后继的细胞因子释放在银屑病的发生发展中扮演了重要角色[9]。IL- 22是由Thl7和Th22等不同来源的T细胞产生的细胞炎性因子。研究发现，IL- 22参与抑制角质形成细胞的分化和异常增生，诱导银屑病样表皮改变[3- 4]。因此，阻断IL- 22的作用将有可能改善银屑病样表皮改变，从而遏制银屑病的发生发展。

近年来，表观遗传学因其在银屑病发病机制中的参与而受到关注，miRNA在银屑病中的作用逐渐被重视[6]。miRNAs可能在银屑病的角质形成细胞的增生、分化和免疫激活异常中发挥重要作用。本文，我们构建了IL- 22诱导HaCaT细胞异常增生模型，并分析了miR- 29a- 3p在调节IL- 22诱导的HaCaT细胞异常增生中作用，初步评价结miR- 29a- 3p在银屑病中的作用。本文是首次报道miR- 29a- 3p参与调节IL- 22诱导的角质形成细胞异常增生。

我们研究发现，IL- 22处理可以促进HaCaT细胞增殖，而过表达miR- 29a- 3p则可以抑制IL- 22对HaCaT细胞的影响。另外，我们发现过表达miR- 29a- 3p可以增加G1期HaCaT细胞的比例，同时减少S期细胞的比例，提示过表达miR- 29a- 3p可以引起HaCaT细胞G1期阻滞，进而抑制细胞增殖。另外，过表达miR- 29a- 3p可以促进IL- 22处理下HaCaT细胞的凋亡。我们的结果说明，miR- 29a- 3p可以抑制IL- 22诱发的角质形成细胞的异常增生。

miRNAs靶基因的鉴定对阐明miRNAs的功能十分重要。通过文献查阅，我们发现miR- 29a- 3p的靶基因之一是信号转导与转录激活因子3(STAT3)[7]。STAT3是一种重要的转录因子，其通过参与Th17细胞分化、角质形成细胞过度增生与异常分化、与炎症细胞相互作用、真皮血管增生等重要病理过程在自身免疫性疾病如银屑病发病中起关键作用[10- 11]。IL- 22作用于角质形成细胞后使细胞中STAT3表达升高[12]。miRNAs可以与靶向基因3′非编码区的互补序列结合，从而抑制靶mRNA翻译成蛋白质或者加速其降解[5]。因此，我们推测miR- 29a- 3p通过降低IL- 22诱导的STAT3高表达而发挥作用。研究发现，抑制STAT3可以诱发细胞周期的G1期阻滞，并促进细胞凋亡[13- 14]，这和miR- 29a- 3p过表达的作用一致。这也可以佐证我们的推测，即miR- 29a- 3p通过降低IL- 22诱导的STAT3高表达而发挥作用。

总之，我们发现IL- 22可以降低HaCaT细胞中miR- 29a- 3p的表达水平。IL- 22可以诱导HaCaT细胞过度增殖和细胞凋亡的抑制，而过表达miR- 29a- 3p则可以抑制IL- 22对HaCaT细胞的影响。基于miR- 29a- 3p对IL- 22诱导的HaCaT细胞的影响，我们推测miR- 29a- 3p可能在银屑病发生发展中发挥重要作用，可能成为新的治疗靶点。