miRNA-141在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其与预后的关系

穆孝慧,艾丽梅

(锦州医科大学附属第一医院 血液科，辽宁 锦州 121000)

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)亚型，约占30%～40%[1]，根据其基因的异质性,可将DLBCL分为3种主要的分子亚型:生发中心B细胞型(germinal center B-cell Like,GCB)、活化B细胞型(activated B-cell like,ABC) 以及第3型(type3)；其中ABC亚型和 type3 预后相似且明显差于 GCB 亚型，故把它们统一归为非生发中心亚型(non-GCB)[2]。目前DLBCL的标准治疗方案是以R-CHOP为基础的免疫化疗，利妥昔单抗的出现使DLBCL治愈率有了一定的提高,但仍有约40%的患者治疗早期即出现耐药或达到缓解后复发[3]，而这些难治性或复发的患者预后较差。

MicroRNA(miRNA)是一种长度较小的非编码RNA[4]，在调控中发挥着重要的作用。miRNA表达水平的增高或下降可能导致多种恶性肿瘤的发生及发展，如在某些恶性肿瘤中，miRNA可能扮演着类癌基因或抑癌基因的作用[5]。miRNA-141是近年来发现的可能具有抑制肿瘤功能的一种miRNA，已有研究实验表明直肠癌患者的病理组织中的miRNA-141的表达水平均较正常者显著降低[6]。本实验旨在探讨miRNA-141在DLBCL中的表达及其与预后的关系，以对DLBCL患者日后的诊断及预后评估提供更多的选择。

1 资料与方法

1.1病例选择 锦州医科大学附属第一医院2017年1月-2019年12月收治的DLBCL患者初始治疗前的石蜡包埋组织标本，均经活检病理学和免疫组织化学分析明确诊断。并在每位入选患者知情的情况下进行随访，得到有详细资料的样本共40例。同时收集性别、年龄相匹配的20例淋巴结反应性增生患者的石蜡组织标本作为健康对照。4%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，全部重新制作苏木精伊红(HE)切片。见表1。

表1 40例DLBCL患者临床资料

1.2随访情况 随访日期截至2020年1月1日，随访时间1～35个月；随访内容主要包括年龄、性别、LDH水平、临床分期、IPI 评分、总生存期(OS)。OS的计算是从诊断确立到淋巴瘤引起的死亡,或随访的终止,以及与本病不相关的死亡算为截尾。前两年每半年随访1次，以后每年随访1次直至失访或死亡。在达完全缓解后仍接受标准的化疗方案。

本组40例患者，随访时间1～35个月，平均随访时间19.2个月，中位随访时间为19个月，死亡18例(45.0%)。40例DLBCL患者的2年总生存率为61.8%。

1.3总RNA的制备 使用天根公司石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒(DP502)提取石蜡切片组织中的总RNA，使用核酸浓度测定仪检测总RNA的浓度和纯度，已制备的总RNA置于-80 ℃保存备用。

1.4RNA逆转录及实时聚合酶链反应(real-time PCR，RT-PCR) ①cDNA制备：使用天根公司试剂盒miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒 (KR211)进行操作。冰上配置如下反应液(表2)，合成cDNA,反应条件：42 ℃ 60 min；95 ℃ 3 min。②RT-PCR反应：使用miRcute 增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green) (FP411)试剂盒进行RT-PCR。室温融化cDNA模板、上游引物(表3)、2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer，之后置于冰上。使用ABI公司PRISM 7300/7500系列RT-PCR仪进行RT-PCR扩增(表4)，反应条件为：95 ℃ 15 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，40个循环。反应结束由计算机自动计算各反应管Ct值。实验重复3次，取平均值。以U6为内参，所测定的miR-141的相对表达量为2-ΔCT，△CT= CTmiRNA-141-CTU6。

表2 反应液体系

表3 miR-141上游、下游及扩增引物序列

表4 RT-PCR反应体系

2 结 果

2.1miRNA-141表达比较 miRNA-141在DLBCL组中的相对表达量为(2.64±1.21)×10-2，在RHL组中为(11.86±1.25)×10-2，miRNA-141在DLBCL组中的表达低于对照组(P<0.01，图1)。

2.2miRNA-141表达与临床因素的关系 miRNA-141相对表达量在GCB和non-GCB型DLBCL中表达差异无统计学意义；miRNA-141在DLBCL中的表达与Ann Arbor分期、国际预后指数、血清LDH水平均无明显的相关性(P>0.05)，见表5。

2.3miR-141在DLBCL中的预后分析 40例DLBCL患者的2年总体生存率为61.8%(图2)。以miRNA-141相对表达量的中位数为分隔点，高于中位数为高表达组，低于中位数为低表达组。miRNA-141高表达组的2年OS为92.2%，低表达组为26.2%。两组的OS差异有统计学意义(P=0.001，图3)。单因素分析，血清LDH≥250 IU/L，IPI≥3分,miRNA-141相对表达量<中位数均与不良预后相关。多因素COX分析，miRNA-141低表达、IPI>3分为均为各自独立不良预后因素(表6)。推测miRNA-141的相对表达量是预测DLBCL的一项独立预后指标。

表5 DLBCL中miRNA-141表达与临床因素的关系

图3 DLBCL中miRNA-141高表达组的总体生存率高于低表达组(P=0.001)

表6 miRNA-141的表达与相关影响因素的 Cox 回归分析

3 讨 论

近年来非霍奇金淋巴瘤的发病率呈上升趋势，弥漫大B细胞淋巴瘤更是其中的主要类型，其作为一种侵袭性淋巴瘤，患者的预后情况也是各不相同的，目前IPI评分是国际上通用的用于预测DLBCL患者预后情况的一项评分指标[7]。在治疗方面，利妥昔单抗联合化疗虽获得了明显疗效,但目前仍有一部分患者为复发难治型，二线治疗手段有限，且治疗效果并不理想[8]。已有大量研究发现在DLBCL的发生及发展过程中存在着miRNA的异常表达：如在DLBCL患者中miRNA-155-5p和miRNA-21-5p的表达上调[9]，而miRNA-224的表达水平显著降低(P<0.05)[10]。此外，有研究发现miRNA-28-5p、miRNA-214-5p、miRNA-339-3p和miRNA-5586-5p的高表达与较好的预后相关，而miRNA-324-5p的高表达提示预后不良[11]。同时有报道发现异常表达的miRNA与DLBCL的不良治疗反应相关：如miRNA-17/92簇、miRNA-224和miRNA-146b-5p在预测DLBCL化疗反应方面有着一定的价值[12]；miRNA-125b和miRNA-130a与DLBCL患者发生化学耐药风险相关，且参与了DLBCL患者的复发和疾病进展过程[13]。

miRNA-141在多种肿瘤中表达下降，推断其有抑癌作用。在大肠癌中,miRNA-141可抑制癌细胞的生长[14]。另外miRNA-141在肝癌组织中表达下降[15]；还有研究结果表明，miRNA-141在人乳腺癌细胞及胃癌细胞中起到抗肿瘤的作用，可以作为潜在的治疗靶点[16-17]。在血液系统恶性疾病中，有研究表明miRNA-141在B细胞急性淋巴白血病(ALL)患儿中的表达明显降低[18]。

本研究得出结论，DLBCL患者的病理组织中的miRNA-141 的表达水平低于淋巴结反应性增生组，推测在DLBCL中miRNA-141可能发挥着抑癌作用，这为疾病的治疗也提供了一个新的可能的辅助诊断指标及治疗靶点；另外通过统计分析，miRNA-141的相对表达量与患者的发病年龄、血清LDH水平、免疫亚型及疾病分期均无明显相关性(P>0.05)。在DLBCL患者中，单因素分析，血清LDH≥250 IU/L，IPI≥3分,miRNA-141相对表达量3分别为均为各自独立不良预后因素。此外，miRNA-141高表达组的2年OS为92.2%，低表达组则为26.2%，高表达组的OS明显高于低表达组，OS有显著的差异(P<0.01)，推断miRNA-141的表达水平可能是判定预后的另一项重要独立指标。关于miRNA-141是如何在DLBCL中实现抑癌作用，查阅文献发现在胃癌细胞中上调miR-141可以抑制阻断磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路[19]，另有研究发现[20]肝癌中circRNA-100338/miR-141-3p轴参与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路。同时有研究发现在DLBCL的发生发展中有PI3K/AKT信号传导通路的异常表达[21]。综上，推测miRNA-141是通过阻断PI3K/AKT信号通路在DLBCL患者中起到抑癌基因的作用，但仍需要进一步的实验去证实这一观点。

本研究探讨了miRNA-141在DLBCL中的表达情况，发现miRNA-141在DLBCL中的表达降低，而且miRNA-141高表达组的预后明显好于低表达组。该研究可以为DLBCL的诊断、治疗及预后分析提供一定的参考意义。