错配修复基因2在膀胱尿路上皮癌中的表达及其临床预后

张春霆， 卢 蓉， 徐 勇

Fishel等[1]在1993年克隆成功错配修复基因2（hMSH2）基因，它位于2p21-22，含16个外显子，编码909个氨基酸。hMSH2在生物进化中相对保守，能降低自发突变、增强DNA复制稳定性以及修复DNA碱基错配功能[2-4]；因此，hMSH2的基因多态性影响肿瘤发生的易感性，并对肿瘤演化和进展有一定的预测价值[5-6]；本文对72例膀胱尿路上皮癌中hMSH2蛋白的表达情况进行研究，并对hMSH2的表达与膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征及5年复发率进行随访研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取浙江省金华市人民医院泌尿外科和天津医科大学第二医院泌尿外科2006年1月—2014年12月手术切除的膀胱尿路上皮癌组织72例，按组织学分级，Ⅰ级45例，Ⅱ～Ⅲ级27例；临床分期Tis～T1期46例，T2～T4期26例，72例患者临床随访资料完整。同时选取正常膀胱黏膜组织49例，所有收集标本患者都经所在医院的医学伦理委员会批准，签订患者知情同意书。

1.2 实验方法 入组的肿瘤组织石蜡标本制作成4 μm厚连续切片，切片脱蜡，3%过氧化氢-微波-甲醇中浸泡10 min以灭活内源性过氧化氢酶，采用免疫组化SP法，在10 mmol/L枸橼酸中煮沸5 min，保温10 min，10%羊血清封闭。兔抗人hMSH2单克隆抗体（1:250）（S-P试剂均为即用型，购自美国Dako公司）。用PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作阳性结照，hMSH2蛋白以DAB显色，苏木素复染。

1.3 免疫组织化学结果判断 高倍镜下观察hMSH2蛋白的分布、阳性强度，计算阳性率。先按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背景着色相对比。再按阳性细胞百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%，染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性(+)。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0统计学分析，计数资料比较采取χ2检验和四格表确切概率法，应用Kaplan-Meier法进行生存分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hMSH2蛋白免疫组织化学染色结果 在膀胱尿路上皮黏膜中，hMSH2蛋白主要表达于细胞质，在细胞浆中表达较少；hMSH2染色在膀胱尿路上皮癌I级和II级中的表达，见图1、2。

图1 hMSH2在I级膀胱尿路上皮癌中的表达（免疫组化，×200）

图2 hMSH2在II级膀胱尿路上皮癌中的表达（免疫组化，×200）

2.2 hMSH2表达与膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征的关系 72例膀胱尿路上皮癌患者中，hMSH2蛋白表达阳性表达率为34.72%(25/72)，49例正常膀胱黏膜组织中hMSH2蛋白表达阳性表达率为91.84%(45/49)，差异有统计学意义(χ2=39.007,P＜0.001)；在膀胱尿路上皮癌Ⅰ级中hMSH2蛋白表达阳性表达率为44.44%(20/45)，高于Ⅱ～Ⅲ级癌的20.00%(5/25)，差异有统计学意义(P=0.025)；hMSH2蛋白中的阳性表达率：在膀胱尿路上皮癌临床分期Tis～T1期中hMSH2蛋白表达阳性表达率为43.48%(20/46)，高于T2～T4期的19.23%(5/26)，差异有统计学意义(P=0.038)，见表1。

表1 hMSH2蛋白表达与膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征的关系

2.3 hMSH2蛋白表达与膀胱尿路上皮癌5年复发率的关系 对hMSH2阳性表达与阴性表达的患者进行5年随访，结果可见31例5年复发的患者中6例hMSH2表达阳性，41例五年无复发患者19例hMSH2表达阳性，进行Kaplan-Meier生存分析结果显示hMSH2表达阴性患者的5年复发率高于阳性患者，差异有统计学意义(P=0.017)。见表2，图3。

表2 hMSH2蛋白表达与膀胱尿路上皮癌5年复发情况的关系

图3 hMSH2蛋白表达与膀胱尿路上皮癌5年复发Kaplan-Meier分析

3 讨论

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤[7]，基因异常参与了膀胱癌发生发展，基因异常主要表现方式为基因突变和异常转录[8-9]，hMSH2在基因突变和异常转录中起非常重要的作用，hMSH2是人类错配修复基因中最早发现的修复异常基因的转录因子，它的功能是当基因出现异常时及时修复，抑癌基因突变率的增加和遗传不稳定往往由于其功能缺陷导致，因此，错配修复基因在膀胱肿瘤演化和进展中可能发挥了重要作用[10-11]。

DNA错配修复缺陷是胃癌遗传不稳定的重要分子机制，微卫星高度不稳定与胃癌预后良好有关。有研究行微卫星检测13例胃癌中hMLH1、hMSH2均未见表达[12]，不仅在胃癌中， hMSH2在其他多种肿瘤中也表现为微卫星不稳定和突变，国内张剑权等[13]对遗传性非息肉病性大肠癌微卫星不稳定基因变异的研究中发现17例肿瘤患者中MSI的阳性率为100%，这17例患者均存在hMLH1或hMSH2表达阴性。在结肠癌中，靶向干扰hMSH2，抑制miR-1290的表达可增强体外和体内结肠癌对5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗的敏感性[14]。本研究对膀胱尿路上皮癌中的hMSH2表达状况进行研究，结果显示hMSH2蛋白在膀胱尿路上皮癌中表达的阳性率为34.72%(25/72)，低于正常膀胱黏膜组织的91.84%(45/49)；hMSH2下降表达与膀胱尿路上皮癌分化程度、临床分期有关，hMSH2蛋白表达的阳性率在Tis～T1期和T2～T4期分别是 43.48%(20/46)和19.23% (5/26)。5年随访发现hMSH2阳性表达的复发率有19.35%，阴性表达的5年随访复发率为46.34%，说明hMSH2基因与膀胱尿路上皮癌的发生和分化有密切关系，缺失表达是膀胱癌中的频发事件。有研究采用免疫组织化学方法检测发现非侵袭性膀胱癌中hMSH2缺失率为25.9%，hMSH2缺失表达引起了p53下降，预后分析中发现hMSH2下降表达在低级别非侵袭性膀胱癌中具有良好的预后意义[15]。本结果也提示hMSH2缺失表达与膀胱尿路上皮癌的5年复发有关。但本研究中由于病例太少不能得出确切结论，有待扩大病例并从基因表达和细胞学方面进一步研究。