高压氧对人胶质瘤172细胞生存的影响

于秋红，李冬果，张琪，任梓齐，嵇江淮，刘亚玲，王丛，薛连璧

脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，约占脑肿瘤的50%左右，手术切除后复发率高，术后复发的主要原因为肿瘤残留[1]，而扩大切除范围则意味着脑功能的损伤，部分患者术后出现昏迷、偏瘫、失语等，给患者、家庭及社会带来沉重的负担。最大程度地切除肿瘤还是保留更多的脑功能经常是临床医生面临的难题。在脑血管病[2-3]、脑外伤等疾病的康复治疗阶段，医生会选择高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)治疗，但在选择肿瘤切除术后患者的康复方案时，采用HBO治疗会格外谨慎。虽然有报道称HBO治疗结合放射性治疗和化学疗法会增强治疗效果[4-5]，减小肿瘤体积、减慢肿瘤生长速度，但单独HBO治疗作用于肿瘤细胞结果不一，有关HBO治疗恶性肿瘤的作用尚未形成定论[6-7]。HBO是否会促进肿瘤生长这一顾虑，在很大程度上妨碍了HBO的临床应用。本研究采用临床经常应用的HBO治疗方案处理人胶质瘤172细胞，观察HBO暴露对细胞生存的影响，以期望对临床安全用氧提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验用细胞株：人脑胶质瘤172细胞由神经外科同事惠赠，购自中国科学院上海细胞库。按常规培养在含10%胎牛血清的改良eagle培养基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中，于37℃、5%CO2条件下培养。根据细胞生长状况换液、传代。试剂：DMEM培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)，多聚赖氨酸、四甲基偶氮唑蓝(Sigma公司进口分装)，二甲基亚砜(北京索莱宝科技有限公司)。设备及仪器：氧舱使用上海减压器厂生产的透明实验舱，流式细胞仪(美国BD公司FACS Verse)、 切片机(Leica EM UC6切片机)、透射电子显微镜(HITACHI-7650)。

1.2 方法 取对数生长期的172胶质瘤细胞随机分为对照组和HBO组，对照组细胞每日在实验舱中置于常压0.1MPa空气中90min，其余时间置于培养箱中，根据细胞生长情况换液、传代等，无特殊处理；HBO组稳压压力为0.2MP，每日HBO暴露1次，共暴露10次，暴露方案具体如下：将胶质瘤细胞置于实验舱中，氧气加压，15min升压至0.2MPa，稳压1h，减压15min，其余时间培养同对照组。

1.3 检测指标 HBO暴露10次后继续培养1d，第11d收集2组细胞，每组细胞观察如下指标：①细胞计数：选取处于对数生长期、生长状态佳且无明显悬浮状态的细胞，按传代步骤得到单细胞悬液，通过细胞计数板显微镜下计数胶质瘤细胞数目。②细胞凋亡比例：根据磷脂结合蛋白Annexin V和7-氨基-放线菌素D (7-amino-actinomycin D，7-AAD)亲和部位及能力不同，用流式细胞仪(BD FACS Verse)检测荧光强度来检测细胞早期及晚期凋亡情况，此过程重复3次。③生长周期：根据不同脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)量结合的荧光染料量不同，用流式细胞仪检测荧光强度来反映细胞增殖状况，用BD公司MODFIT软件分析，此过程重复3次。④超微结构：透射电镜下观察细胞超微结构。

2 结果

2.1 细胞计数 2组对数生长期的172胶质瘤细胞都贴壁生长，无明显悬浮死亡细胞，对照组细胞计数(4.19±0.09)×105个，HBO组计数(4.03±0.07)×105个，HBO组细胞计数明显少于对照组(t=3.2，P=0.01)。

2.2 2组凋亡细胞比例 本研究用AnnexinV与7-AAD进行细胞染色，AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故早期凋亡细胞呈现AnnexinV染色阳性(Annexin V+/7-AAD-)，晚期凋亡细胞则染色呈现双阳性(Annexin V+/7-AAD+)。HBO组早期和晚期凋亡细胞比例均明显高于对照组(均P<0.01)，见表1。

表1 2组凋亡细胞比例

2.3 细胞生长周期 HBO组G1期细胞比例为(57.26±3.56)%，对照组为(59.48±5.32)%，2组比较差异无统计学意义(t=0.780，P=0.460)；HBO组S期细胞比例为(40.91±5.37)%，对照组为(35.23±5.31)%，2组比较差异无统计学意义(t=1.680，P=0.130)；HBO组G2期细胞比例(1.2±0.26)% 较对照组(5.41±0.86)%明显减少(t=10.420，P<0.01)。此外，HBO组肿瘤细胞出现凋亡和死亡细胞(绿色图例)，其比例约占6.8%，见图1a～b 。

2.4 细胞超微结构 对照组细胞周围突起密集、细长，而HBO组细胞突起较对照组减少，形状短小，见图2a～b。

3 讨论

Nature杂志曾发表了天主教鲁汶大学的研究结果[8]，研究分析了3000多例患者肿瘤样品，发现当氧气缺乏时，甲基基团过度的添加到DNA上。超甲基化这种表观遗传(不影响遗传密码，但强烈干扰基因功能)阻止肿瘤的抑制基因表达，因而能够让细胞产生异常行为，导致肿瘤过度生长。而在小鼠体内，当肿瘤的血液供应正常化时，可以阻止这些表观遗传变化。实验室人员也正在开展聚焦于血管正常化疗法的新研究。

常压下机体主要依靠血红蛋白输送氧气，治疗无疑受制于血管正常，而高压氧则是增加物理溶解氧，只要有液体存在的地方就能有氧气供应，无疑能很好的解决缺氧的问题。最近Science杂志发表了Chakraborty等[9]的研究，证实组蛋白脱甲基酶KDM6A(histone demethylase，KDM6A)具有直接感受环境缺氧的能力，它的减少或缺失就像缺氧一样可以直接阻止组蛋白H3赖氨酸27(Histone H3 lysine 27，H3K27)的去甲基化，与前文的缺氧导致超甲基化异曲同工。在缺氧细胞中补充KDM6A可以恢复H3K27的甲基化平衡。这表明氧可以直接影响染色体调整因子，控制细胞命运。基于此，本研究拟将胶质瘤172细胞作HBO处理，观察肿瘤细胞生长情况，电镜下观察肿瘤细胞微结构。与Selvendiran 等[10]从卵巢癌得出的结论相似，本研究发现HBO暴露后胶质瘤172生长速度也减慢。兰川等[11]和赵秀文等[12]的研究亦提示GL261胶质瘤细胞HBO培养后细胞繁殖能力下降、细胞计数减少。这些都提示HBO并没有促进肿瘤细胞生长。此外，本研究提示HBO暴露后胶质瘤172细胞更多的阻滞在S期，这与凋亡细胞染色结果的趋势是一致的，HBO使G2期细胞减少，有将细胞阻滞在S期的趋势，并且促进细胞凋亡。这与兰川等[11]和赵秀文等[12]的研究结果发现HBO培养后胶质瘤细胞更多的阻滞在G0～G1期不同，考虑原因一是HBO暴露方式不同，本研究是常规培养，采用临床常用HBO剂量进行暴露，而兰川等[11]的研究则是将胶质瘤细胞一直在高压高氧环境中培养，造成二者HBO暴露剂量不同；另外研究采用的胶质瘤细胞系不同，不排除这也可能造成结果差异。

此外，值得注意的是，张伟等[13]观察到结肠癌LoVo细胞在应用0.2MPa的HBO暴露且在暴露后24h时，细胞积聚在S期最明显，此时应用细胞周期特异性化疗药物氟尿嘧啶，可显著增强药物效果，且浓度越低显效越早，考虑可能是采用高浓度药物早期即可达治疗效果，而低浓度药物本身不足以达到治疗效果，联合应用HBO后随时间延长才显示联合应用更优的效果。这些都提示我们临床中更应注意HBO的剂量和治疗时间窗，根据病理结果，选取合适的HBO剂量在不同的时期介入，可能会影响化疗药物的选择。进行个性化的精准治疗，可能有助于减小药物剂量，减轻毒副作用，使患者预后更佳。

正是实体肿瘤内部的缺氧微环境，在肿瘤的恶性进展中发挥着重要的作用[8,14-15]。而HBO作为唾手可得的纠正缺氧的物理治疗，理应得到更多的关注。除了增加血脑屏障开放、促进化疗药物进入肿瘤组织[16]，本研究再一次证实HBO本身对肿瘤细胞也产生了一定的抑制作用，促进细胞凋亡可能是机制之一。与脑梗死大鼠HBO治疗改善缺氧，使细胞存活而凋亡减少不同[17-18]，本研究提示HBO使得胶质瘤凋亡细胞增加，这与万文武等[19]的研究结果是相符的，考虑HBO使得凋亡细胞增加，从而坏死细胞相对减少，减轻能量消耗，阻断了肿瘤进一步缺氧。HBO已逐渐成为一种治疗基础疾病过程及疾病本身的药物[20]。

目前的研究认为肿瘤组织中存在肿瘤干细胞，具有强烈的增殖能力和自我更新能力[21]，并能分化成子代肿瘤细胞，保持肿瘤的不断生长，是肿瘤复发和转移的关键，而这种能力与细胞表面的突起有关，可能涉及到多种微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，MicroRNA)的作用[22]。本研究发现HBO暴露后，胶质瘤细胞表面突起短缩，数量减少，考虑肿瘤细胞增殖转移能力下降。这可能和HBO影响了细胞的MicroRNA有关，我们正在进行相关研究。

总之，细胞增殖、凋亡和DNA损伤等，是恶性肿瘤发生、发展以及决定癌细胞对放射或化疗药物敏感性的重要分子病理学基础。本研究显示：HBO减慢了肿瘤细胞生长，促进细胞凋亡，使更多的细胞阻滞在S期，使与肿瘤的转移、复发有关的突起变短、减少，初步显示了HBO对肿瘤细胞的抑制作用。我们正在进一步的研究，以便对临床安全用氧提供更多的理论依据。