3D打印β-磷酸三钙仿生骨支架修复兔股骨髁骨缺损

段钢 陈宏亮 郭开今 陈向阳

骨缺损是骨科常见的病理现象，多出现于肿瘤切除、运动损伤和感染等疾病患者，可能对人体正常肌肉骨骼系统和心理造成严重损害，通常需要通过手术植骨对病灶进行修复[1-2]。近年来骨修复相关研究取得了很大进展，但由于骨修复是一个复杂的过程，骨缺损真实形态和功能的重建仍然面临巨大的挑战。较大体积骨缺损的修复是临床治疗的难点，也是目前骨组织工程研究的热点。自体骨被认为是替代骨的最佳材料，但是供骨来源有限，同时自体骨移植手术存在扩大创伤、增加感染的风险；同种异体骨需要经过灭菌和灭活后应用，虽然存在骨支架的解剖结构，但是失去了成骨诱导和骨生成作用，且存在免疫排斥和传播疾病的可能，同时受到其他经济和伦理方面等因素的影响，其应用也受到了一定限制[1]。因此，研发一种结构和性能稳定、具有骨传导和骨诱导生成作用的骨修复材料对于临床骨缺损的修复有重要意义[3-5]。β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)是一种新型骨填充材料，具有易于塑形、可诱导成骨、在体内降解、生物相容性好等优点，目前在临床骨修复治疗中已经得到应用，是一种较理想的骨修复替代材料[6-8]。3D打印技术可以精准快速打印出所设计的具有复杂形态的个性化人工骨支架，其低温打印技术可以使用多种组织工程材料。通过3D打印技术以β-TCP为材料制备的仿生骨支架既具备必需的支撑强度，同时后期又不会妨碍新生组织的生长，使骨传导及时获得有效的血液供应。β-TCP是3D打印人工骨支架的理想材料[9-10]。本研究以β-TCP为材料，采用3D打印技术制备仿生骨支架，观测其结构形态、孔隙率和力学强度，同时以动物实验检测其部分相关生物性能，为3D打印β-TCP仿生骨支架的临床用应提供理论支持。

资料与方法

一、主要材料、设备和实验动物

β-TCP粉末(英国百赛公司，英国)、稀柠檬酸、磷酸氢二钾、氧化锌、二氧化硅(自备)；JSM-5600LV扫描电镜(日本电子株式会社，日本)；3D-BIOPLOTTER®三维生物打印系统(EnvisionTEC 公司，德国)；新西兰大白兔(徐州医科大学动物中心，中国)。

二、β-TCP仿生骨支架的设计和制备

1. 3D打印墨水的制备：在β-TCP粉末中加入20 wt%柠檬酸以固液比1∶0.35混合，调和至稀糊状，加入定量磷酸二氢钾、氧化锌、二氧化硅，搅拌均匀后，在37℃、100%湿度环境中固化72 h备用。

2. β-TCP 仿生骨支架的制备：将通过显微CT扫描获得的新西兰大白兔股骨髁解剖结构影像参数导入计算机Mimics 15.01软件，应用Geomagic Studio 2013软件分割出股骨髁内部骨小梁的结构数据，最后采用系统默认的最优三维重建方式进行实验部骨骼内骨小梁仿真结构的三维重建。以系统控制软件设计大体形态为直径8 mm、长10 mm圆柱体，内部为仿生骨小梁和孔隙构成，孔隙率(内部孔隙体积占总体积的百分比)为65%的支架构型，以STL格式输入3D打印机，调用200 μm喷头，行走速度为100 mm/min，制备β-TCP仿生骨支架成品25枚，均采用γ射线消毒处理。以随机数字表法对其中10枚β-TCP仿生骨支架的大体形态、内部微观结构以及力学性能进行检测；另外15枚β-TCP仿生骨支架备用于动物模型实验。

3. β-TCP 仿生骨支架大体型态的测量：使用游标卡尺测量实验制作的β-TCP仿生骨支架成品大体形态。分别对每个支架的高度和直径进行测量，同一层面测量3次，通过获取每个支架指标平均值计算支架大体型态的相应平均值。

4. β-TCP 仿生骨支架内部孔径形态及孔隙率的测定：通过数码相机和JSM-5600LV扫描电子显微镜对固化后的β-TCP仿生骨支架的孔道结构进行观察。根据Geomagic Studio 2013软件设计的仿生骨支架的三维形态，可以直接使用计算机测算支架结构仿生骨小梁直径，以及连通孔道的内径和孔隙率，每个测量层面随机选取3个大孔和3个微孔进行测量，通过获取每个支架的对应平均值计算支架整体内部孔径形态及孔隙率的平均值。

5. β-TCP 仿生骨支架力学性能的检测：使用万能力学试验机(AG-2000A，岛津公司，日本)以载荷速度0.5 mm/min、最大压力2 000 N对β-TCP 仿生骨支架的压缩强度进行测量。对10个平行样本进行静态压缩力学性能(压缩力学强度)测定，样品在37℃磷酸盐缓冲液中浸泡36 h，压缩加载速度为0.1 mm/min，温度为25℃。β-TCP生物陶瓷是脆性材料，断裂即失效[11]，因此以最大拉应力理论作为其断裂准则。采用ANSYS 14.0有限元分析软件对数据进行分析，最大拉应力对应于第一主应力，将β-TCP仿生骨支架的极限拉应力作为临界第一主应力进行有限元分析，根据压力-应力曲线获得数据，查文献获得泊松比为0.28[12]。

三、动物实验

本实验研究获徐州医科大学伦理委员会审批。实验在徐州医科大学动物实验中心完成。随机选取新西兰大白兔30只，性别不限，体质量2.0～2.5 kg，饲养1周后，以抽签法将动物随机分配为实验组和对照组，每组15只。使用3%水合氯醛以3 ml/kg剂量对实验兔进行腹腔注射麻醉，起效后常规备皮、消毒铺单。取兔左膝关节外侧长2 cm切口，显露股骨远端，于侧副韧带与腓侧韧带之间中点处，平行膝关节横轴钻直径约8 mm、长约10 mm圆柱形骨缺损，以生理盐水冲洗创面，清除骨屑和凝血块，以干纱布填塞，使骨面保持干燥。实验组植入预先制备的个性化β-TCP仿生骨支架，对照组不植入任何材料，之后逐层缝合深筋膜、浅筋膜和皮肤。术后分笼饲养，每天肌肉注射青霉素10×104 U/kg，连续3 d。观察术后实验动物的饮食、活动及伤口情况。在术后第4、8、12周对两组各5只兔行麻醉下手术，分别对实验组兔植骨部位和对照组兔骨缺损部位进行取材，以10%甲醛溶液固定，常规脱钙、脱水、石蜡包埋、沿垂直方向切片和HE染色，使用光学显微镜观察有无炎性反应、骨组织长入以及材料降解情况。

四、标本组织学评价

依据光学显微镜下所见，采用Lane-Sandhu组织学评分方法(表1)对实验组兔术后植入β-TCP仿生骨支架部位和对照组兔术后骨缺损部位的骨愈合情况进行评价。

五、统计学处理

结 果

一、β-TCP仿生骨支架的形貌和结构特征

β-TCP仿生骨支架的大体外观结构均与设计形态接近，直径为(7.89±0.07)mm，高度为(9.97±0.08)mm(图1)；表面及内部可见类似于骨组织的结构形态，小梁交错连接，中间孔隙相互连通，大孔的周围布满更小的微孔，小梁直径5～50 μm，其间较大孔道内径为(223.02±18.20)(200～300)μm，微孔内径为(15.06±0.09)μm，孔隙率为(65.10±1.38)%，与设计参数接近，差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。β-TCP仿生骨支架具有较好的贯通结构，与骨骼结构形态有极佳的相似性，且无明显收缩形变，各项大体形态参数值见表2。

二、β-TCP仿生骨支架的生物力学强度

β-TCP仿生骨支架平均最大压缩强度为(3.83±0.65)MPa(表2)。β-TCP仿生骨支架压缩应力-应变曲线的第1个峰为支架的抗压强度。由第一主应力分布云图可见，当第一主应力作用时受力最大的部位是材料中部(图3)。

三、动物实验结果

实验兔术后第2天即正常饮食；术口无红肿等炎症迹象，一期甲级愈合；手术侧肢体跛行，平均1周后可正常行走，观察期间行动自如；1只兔死亡，二次手术补齐。组织学观察结果：术后4周，实验组

表1 Lane-Sandhu组织学评分方法

图1 对β-TCP仿生骨支架成品进行大体形态测量 A 支架正面(侧面)观 B 支架上面(横截面)观 C 多枚支架 D 使用游标卡尺测量支架横截面直径

图2 实验兔股骨髁骨微观结构的Micro-CT三维重建像与扫描电子显微镜下β-TCP仿生骨支架内部结构形态 A,B 根据Micro-CT扫描松质骨标本内部结构所得数据进行三维重建像的侧面观与横截面观，可见骨小梁呈网状结构，孔径相互连通，大小不均 C,D 扫描电子显微镜下β-TCP仿生骨支架的内部微观结构形态，仿生骨小梁连接成网状结构，中间形成较大的孔径相通，仿生骨小梁上分布微孔，与大孔径相连，图像显示标尺分别为200 μm和50 μm兔植骨处可见较成熟的骨组织，骨小梁和骨髓组织增多，新生骨正在逐渐取代植入材料，对照组兔骨缺损处周围可见少量成骨细胞；术后8周，实验组兔植骨处可见植入材料周围出现骨小粱、成骨细胞和破骨细胞，同时出现少量新生骨并向植入材料内长入，对照组兔骨缺损处周围有少量类骨组织形成，大量成纤维细胞和脂肪组织长入；术后12周，实验组兔植骨处出现成熟的骨小梁和骨髓组织，有编织骨形成，新生骨量较多，植入材料存留较少，表示已转化为成熟骨组织，对照组兔骨缺损处见少量骨组织从缺损边缘向内长入，大部分被成纤维细胞和脂肪组织填充(图4，5)。两组Lane-Sandhu组织学评分差异有统计学意义(表4)。

表2 β-TCP仿生骨支架大体形态指标和生物力学强度

图3 使用万能力学试验机(AG-2000A，岛津公司，日本)以载荷速度0.5 mm/min、最大压力2 000 N对β-TCP仿生骨支架进行力学测试 A 放置样品，测试应力 B 抗压强度实时检测 C 样品抗压应力-应变曲线 D 第一主应力作用分布云图

讨 论

广泛创伤、肿瘤、感染或先天性肌肉骨骼疾病等可能造成严重的骨缺损，植入生物材料修复骨缺损并促进骨再生是目前临床研究的热点。骨缺损愈合是一个骨组织重建的过程，通常需要经过一个有重叠时间线的多维过程。骨有再生能力，绝大多数骨缺损在适宜的生理环境条件下可自发愈合。然而，骨缺损的愈合过程是一个耗时的过程，由于骨折部位供血减少，钙磷对新骨的强化和硬化作用不足，新骨生成缓慢。此外，由于受到缺损较大或不稳定的生物力学特性、不利的伤口环境、不理想的手术技术、代谢水平低、激素和营养水平不足以及所施加的压力不当等因素的影响，大缺损(关键性骨缺损)可能不会自发愈合并导致骨不连[13]。

骨移植或骨替代生物材料植入是临床骨外科修复大段骨缺损常用的治疗策略。尽管自体骨移植是目前骨缺损的金标准治疗方法，但它仍然存在一些缺点，如供体供应受限、供区疼痛或出血等。同种异体骨移植方法的主要缺点是存在免疫介导的排斥反应风险、传染病传播以及对移植体力学和生物学特性的负面影响。为了克服骨移植治疗骨缺损的局限性，在过去几十年中，越来越多的学者关注并研究由天然衍生和(或)合成材料制成的骨替代生物材料。理想的人工骨支架应当具备以下特点：适合的三维多孔结构；较高的孔隙率和连通性；较好的机械强度和降解性，不妨碍新生骨的生长与重建；无或低的免疫原性、组织相容性好；价格适中，易于制备等。目前大部分多孔生物材料不具备以上特点，不利于骨再生。有研究结果表明，骨组织工程材料β-TCP有非常好的生物相容性，可有效促进和诱导骨组织再生，较高的降解率也有显著优势[14-15]。

3D打印技术不需要机械加工和模具，能够直接根据计算机图形数据快速制作任何形状的物体，尤其适用于设计和制造结构不规则且不均质的人工骨支架。这一独特的优势使3D打印技术在骨组织工程材料方面有着更广阔的应用空间[16-17]。

目前，实验兔是肌肉骨骼相关研究中首选的模型动物[18]。与其他物种相比，兔与人在骨密度和骨干中段骨的断裂韧性方面有相似之处，具有更快的骨骼变化和骨转换过程，符合比较和评价骨替代品的成骨性能和特点的要求[19-20]。近年来，兔股骨远端骨缺损模型已被研究者普遍用于测试新的骨替代生物材料[21-23]。Barbeck等[24]使用直径7～10 mm临界尺寸的圆柱形骨缺损兔模型成功研究了可注射磷酸钙骨替代物在骨再生中的应用。在进行人体临床试验之前应用兔股骨远端缺损模型测试替代生物材料具有建设性意义。

本实验研究采用3D打印技术制备实验兔股骨的β-TCP仿生骨支架。通过电子显微镜观察到所制备的β-TCP仿生骨支架表面及内部与实验兔股骨相似，仿生骨小梁交错连接，中间孔隙相连通，大孔周围布满小微孔，结构直径和连通孔道的孔径都与设计参数相同，内部具有较好的贯通结构，与实验兔股骨形态结构匹配，无明显收缩形变,抗压强度在松质骨抗压强度区域值(2～12 MPa)之内[25]。本研究实验组与对照组在术后4、8、12周兔股骨骨缺损处新生骨细胞计数差异有统计学意义，表明实验所构建的β-TCP仿生骨支架利于细胞附着和微血管长入，利于新骨生成与重建。其中术后8、12周两组数据差异更为显著，同时组织切片显示支架开始降解，周围未见明显炎性反应，表明β-TCP仿生骨支架对于实验兔机体组织无明显细胞毒性。有研究结果显示， β-TCP仿生骨支架在实验兔体内的降解时间为3～6个月，与松质骨缺损的修复时间相当，在修复骨缺损的过程中植入材料的降解与成骨达到了较好的匹配。β-TCP在降解过程中产生钙和磷等离子，可为新骨的形成提供所需要的物质成分，同时其代谢产生的弱碱性离子可以提高内环境的pH值，降低酸

图4 实验组与对照组兔股骨骨缺损部位组织学观察结果 A～F 分别为对照组术后4、8、12周骨缺损处组织光学显微镜下像(标尺分别为400、100μm)，术后4周缺损处出现纤维组织及脂肪细胞，周边有少量骨细胞，术后8周和12周骨缺损处出现较多新生纤维组织及脂肪细胞，周边出现新生骨细胞，及少量骨小梁向缺损中部生长 G～L 分别为实验组术后4、8、12周骨缺损处组织光学显微镜下像(显示标尺分别为400、100μm)，术后4周时骨缺损处支架周边孔径内出现新生骨及纤维组织，支架有少许降解，术后8周和12周时支架处逐渐出现钙化的板层骨和较厚较粗的新生骨小梁(黄色箭头所示)，新生骨组织与支架紧密贴附，支架部分已降解性环境下发生炎性反应的概率。β-TCP在骨组织工程材料中将占有非常重要的位置[26-27]。

图5 实验组兔股骨髁修复处大体标本 A 术后第4周兔股骨髁缺损处已有少量填充 B 术后第8周兔股骨髁缺损处由新生骨组织大部分填充 C 术后第12周兔股骨髁缺损处已由新生骨组织完全填充

表3 实验组与对照组兔股骨骨缺损部位术后Lane-Sandhu组织学评分

综上所述：应用3D打印技术制备兔股骨β-TCP仿生骨支架，其形态结构与兔股骨解剖形态相似，且具有良好的骨引导作用和生物力学性能；β-TCP是一种较为理想的骨缺损修复材料；现阶段尚缺乏能很好地模拟骨缺损修复临床条件的理想动物模型；如何更精准地调控β-TCP仿生骨支架的结构、机械强度和生物相容性以及β-TCP仿生骨支架的临床应用将是我们进一步研究的方向。