牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Ltp1的表达、纯化及酶学性质研究

顾前程，夏 荣，孔文文

牙周病是人类口腔的常见病和多发病。牙菌斑生物膜的形成和堆积是牙周病的直接原因，菌斑微生物可通过自身代谢产物引起组织破坏；也可通过刺激或改变宿主的自身免疫反应间接危害宿主[1]。牙龈卟啉单胞菌是目前公认的牙周致病菌[2]。其致病性主要体现在：表面结构和蛋白酶直接起着黏聚分子的作用；可产生多种胞外蛋白酶、内毒素、磷酸酶，均可对牙周组织产生破坏作用[3]。而酪氨酸蛋白酶(tyrosine protein phosphatase, PTPs)正是这些毒力因子中的一种。Maeda et al[4]发现，在牙龈卟啉单胞菌基因组中，存在PG1641基因，推测它表达了一种低分子量Ltp1。关于该蛋白酶的酶学性质研究，Maeda et al[4]采用了突变法表达此蛋白；并以孔雀石绿检测法，证实其为酪氨酸磷酸酶蛋白，同时检测不同金属离子对酶活性质的影响，但未对目的蛋白的反应温度和相应pH做相应检测。该研究通过生物学技术对目的基因进行直接合成，并以原核表达系统表达出数量较多、纯度较高的目的蛋白，简化步骤方法，同时对其进行活性检测及晶体学初筛，为后续蛋白结构研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器大肠杆菌BL21(DE3)(上海Invitrogen)；pET29a载体改造后的p29载体(北京Novagen)；质粒抽提试剂盒 (美国Axygen)；PCR回收试剂盒 (美国Axygen)。引物与目的基因：PCR扩增引物、目的基因PG1641由通用生物系统(安徽)有限公司合成 ；序列测定：上海生物工程技术服务公司、通用生物系统(安徽)有限公司。化学试剂：克隆位点(5’ NdeI和3’Xhol)、Luria-Bertani(LB)培养基、琼脂、卡那霉素、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)(美国Merck公司)、HEPES缓冲液(pH7.4)、1 mol/L 咪唑、5 mol/L NaCl、Buffer：50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl 、蛋白纯化洗脱液：50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl 40 ml、20 A:20 mm咪唑30 ml(5 mol/L咪唑120 μl加buffer至30 ml)、20B:20 mm咪唑30ml(5 mol/L咪唑120 μl加buffer至30 ml)、300 mm咪唑6 ml(5 mol/L咪唑360 μl buffer 5640 μl)、小鼠抗His标签单抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、ECL底物发光显影定影试剂盒(以上实验材料均来自美国Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1基因合成 参考GeneBank上PG1641目的基因序列(编号为：NC_002950.2)，对PG1641目的基因序列分析后进行密码子优化，使其适合于原核表达系统，交于通用生物系统(安徽)有限公司合成(合同编号G0131961)，将PG1641构建于pET19-b载体上，克隆位点分别是NdeI-XhoI。

1.2.2LTP1蛋白重组质粒的构建 将合成的基因载体，用CloneExpress同源重组方法重新构建质粒表达系统pET29-PG1641-His。在设计引物时要设计目的基因以及载体线性化的引物，目的基因的正反向引物要和载体的线性化引物有15～20 bp的同源序列，这样可以在重组酶ExnaseⅡ的催化下发生同源重组。根据Ltp1 PG1641(513 bp)基因序列设计上下游引物，上游引物PG1641-S：5’-AGGAGATATACATATGAAGCCGCATAAAATTCTGTT-3’；下游引物PG1641-A：5’- GGTGGTGGTGCTCGAGATCGCAGGCGCTCAGACTAC-3’。

1.2.3重组质粒载体的扩增与鉴定 ① 将同源重组法构建的pET29-PG1641-His载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，将转化后产物均匀涂在含卡那霉素抗性的LB固体培养基上，置于37 ℃恒温培养箱过夜。② 筛选阳性克隆并进行菌液PCR，同时将菌液做琼脂糖电泳检测，并送测序(上海生工生物有限公司)，在NCBI上以Blast软件进行序列对比和分析，将正确结果的菌液进行质粒返还，将回收的质粒进行琼脂糖电泳。

1.2.4Ltp1蛋白的表达与纯化

1.2.4.1Ltp1的转化与表达 将返还验证后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，之后将转化的菌液加入LB液体培养基中(卡那霉素抗性)，37 ℃摇床培养至吸光度(optical density，OD)600 nm: 0.6～0.8时，加入IPTG，16 ℃摇床上诱导过夜表达。Beckman离心机(4 000 r/min，15 min)收菌。每罐菌体以20 ml 20 mm Tris-HCl pH7.5 150 mm NaCl 重悬，分装至10个15 ml试管中，-30 ℃冰箱保存。

1.2.4.2菌液破碎与制样 取上述菌液，化冻后倒出半管菌液至50 ml小烧杯中，加入50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl至30 ml。将小烧杯放置冰上，进行冰浴超声破碎(功率42%，总时间30 min,破2 s,停2 s)，破碎后菌液离心(12 000 r/min, 30 min)，沉淀用buffer重悬，将上清液和沉淀分别制样。

1.2.4.3Ltp1镍柱层析粗纯化 将上清液样品进行镍离子亲和层析：先用10倍柱体积50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl冲洗平衡镍柱，然后加入上清液样品，设置流速5～6 s 1滴，流完后先用40 ml上述buffer流速设置2～3 s 1滴，之后分别用2管30 ml 20 mm咪唑洗脱杂蛋白流速2～3 s 1滴，最终用6 ml 300 mm咪唑洗脱下目的蛋白(流速5～6 s 1滴)，并且分别制样，和上述上清液、沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4.4Ltp1分子筛细纯化 将300 mm咪唑洗脱下的目的蛋白分装在6个1.5 ml EP管中，12 000 r/min离心10 min，之后用分子筛层析进一步分离细纯化。先用配置好且已经超声除气好的buffer(50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl )冲洗S75凝胶层析柱，平衡柱子，流出速度为1.0 ml/min，柱压为0.7 MPa，冲洗体积为120～140 ml。然后将6 ml 150 mm咪唑洗脱下且离心好的蛋白质样品通过注射器上样，设置流速1.0 ml/min，柱压0.7 MPa，每管接样体积1.4 ml，紫外灯280 nm进行检测。大约当冲洗体积是70～90 ml时紫外OD值发生变化，软件上出现一个尖锐峰，收集此峰范围内EP管所接样品并标记。对所收集样品紫外分光光度仪测浓度并分别制样跑电泳检测。

1.2.5Western blot鉴定重组蛋白 将上述细纯化收集的目的蛋白样品加入浓缩管(美国Millipore)，截留分子量大小10 ku蛋白质，4 ℃、3 200 r/min 离心机离心10 min。紫外分光光度仪测OD值，直至蛋白质浓度浓缩达10 mg/ml以上。采用Western blot法对浓缩样品进行检测：一抗为小鼠抗His标签单抗，二抗为稀释为1 ∶3 000的HRP标记的羊抗小鼠IgG，将细纯化浓缩后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，用PVDF膜转模，脱脂牛奶37 ℃封闭1 h，洗3次；加入小鼠抗His标签单抗(一抗)(1 ∶2 000)，室温结合1 h，洗膜5次；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG(二抗)(1 ∶3 000)，室温结合45 min，洗5次，ECL底物发光显影定影试剂盒显色，使用X线曝光分析结果。

1.3 Ltp1酶学研究

1.3.1OD变化 室温下，以对硝基苯磷酸二钠为显色底物溶液，与纯化所得目的蛋白反应，以NaOH终止反应，使用DU800监测A405 nm OD变化[5]。实验组为底物对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)溶液同时加入PG1641目的蛋白参与反应，空白组为单独底物p-NPP溶液不加目的蛋白PG1641。

1.3.2不同反应温度对蛋白活性影响 将1.3.1中温度分别设为37、50、75 ℃，加入目的蛋白，其他条件不变，进行显色反应。

1.3.3不同pH对蛋白活性影响 配置不同pH反应液，pH分别为5.0、6.0、7.4、9.0，加入目的蛋白，其他条件不变进行显色反应。

1.3.4酶活测定 在室温下，50 mm HEPES 150 mm NaCl pH7.4条件下，将细纯化目的蛋白与不同浓度对p-NPP反应，测OD值，最后应用双倒数作图计算Km和Vmax值。

2 结果

2.1 Ltp1表达载体的构建图1为琼脂糖电泳结果：从NCBI上得知PG1641目的基因为513 bp,琼脂糖电泳结果与目的基因大小基本一致，在500多bp左右；图2显示，质粒回收后琼脂糖电泳结果也与实际结果一致。图3以生物学信息软件ExPAsy软件生物学信息软件分析知Ltp1蛋白PI值约为4.99，理论相对分子量约为18.75 ku。

图1 p29-PG1641菌液PCR后DNA琼脂糖电泳

M：DNA Marker；1、2、3、4、5、6：均是菌液PCR后目的基因PG1641

图2 质粒回收后琼脂糖电泳

M：DNA Marker；1、2、3、4：回收的PG1641目的基因

图3 ExPASy软件分析结果

2.2 Ltp1蛋白的大量表达将构建成功的原核表达载体p29-PG1641-His转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经过IPTG诱导表达，收菌、离心破碎、纯化后，SDS-PAGE结果显示：与理论值18.75 ku大小基本符合，且粗纯化和细纯化后在上清液和300 mm咪唑洗脱液中均存在目的蛋白Ltp1。图4为镍柱亲和层析粗纯化SDS-PAGE结果：可以观察到上清液和300 mm咪唑洗脱液条带范围大约在18.4～25.0 ku之间；图5为分子筛细纯化样品SDS-PAGE结果：可以观察到管数51、53、55、57、61、63、65均有目的蛋白。

图4 镍柱层析样品粗纯化SDS-PAGE

M：蛋白Marker；1：上清液；2：流穿；3：buffer；4：20 mm咪唑洗脱液；5：20:mm咪唑洗脱液；6：300 mm咪唑洗脱液

图5 分子筛尖峰下细纯化样品SDS-PAGE

M：蛋白Marker；51、53、55、57、59、61、63、65：分别为分子筛A280尖峰下对应样品管数

2.3 Western blot测定将分子筛细纯化样品浓缩后的目的蛋白进行Western blot分析，显色后在PVDF膜上出现单一条带(图6)，表明表达的目的蛋白确实是带有His标签的Ltp1目的蛋白。

M：蛋白Marker(Easy-see marker)；1、2、3、4：均是分子筛样品浓缩后PG1641蛋白

2.4 Ltp1酶学检测结果Ltp1可催化p-NPP产生黄色产物p-NP。纯化后所得目的蛋白具有典型磷酸酶活性(图7)，且在pH 5.0～6.0均具有较高催化活性(图8)，随着pH升高，活性逐渐降低；37～50 ℃时，活性最高(图9)。

图7 酶活反应

图8 pH检测

图9 温度检测

2.5 酶活结果在不同浓度p-NPP底物条件下，与重组目的蛋白反应，测定其初速度(1/V)，以1/V和1/S做双倒数图，求得重组蛋白的Km和Vmax分别为：70.4 μmol和51.1 μmol/(L·min)。

图10 米氏常数Km和最大反应速度Vmax测定1/V：反应速度倒数；1/S：底物浓度倒数

3 讨论

牙龈卟啉单胞菌是口腔中一种革兰阴性厌氧菌，与齿垢密螺旋体、福赛坦氏菌共称为“红色复合体”，和晚期牙周病变密切相关[6]。具有对牙周组织高度破坏性，这主要归因于其特有的毒力因子库。而Ltp1正是毒力因子库的多功能调节剂：首先这种病原体不产生铁载体, 相反，它以特定的菌毛蛋白,促进Ltp1释放，以此来加速血红素的摄取，最终调节胞外多糖合成[7]；Ltp1还可以促进牙龈素(RgpA、RgpB或Kgp)等蛋白酶的产生，这些蛋白酶为糖酵解提供了肽底物，用于降解牙龈纤维和宿主产生的免疫效应分子,并且牙龈素已被公认为是生物体的主要毒力决定因素[8-9]；Ltp1还可参与约束单种菌斑生物膜和异型菌斑微生物膜的累积，例如在牙龈卟啉单胞菌和戈登链球菌异型微生物社区中，第一步就是由2个不同的黏附素受体介导的共价黏附作用[10]；除此之外，Ltp1还可干扰细菌种间AI-2信号的传导，主要是通过负调节LuxS的转录，从而使细菌黏附受到干扰[11]。

本研究将牙龈卟啉单胞菌目的基因PG1641重组至带有His标签的pET29载体上，利用大肠杆菌BL21进行诱导表达。SDS-PAGE电泳检测到相对分子量约为18.75 ku的目的蛋白，Western blot鉴定了该重组蛋白。通过与其底物p-NPP反应得知其酶活Km和Vmax分别为70.4 μmol、51.1 μmol/(L·min)，在pH 5.0～6.0和37～50 ℃具有较高活性，后续实验将对其进行进一步优化，以期获得纯度更高且不含标签的的目的蛋白。为下一步晶体学初筛，晶体条件的探索奠定基础，这样就可以从结构生物学角度明晰其致病机理，也可为牙周炎的免疫治疗、靶向药物研究提供方向。