3种改进液相色谱法测定植物油中黄曲霉毒素的比较研究

杨 静, 张晓燕，洪 玲，沈 娜，黄 力，许艳霞

(1.湖南省粮油产品质量监测中心，长沙 410201; 2.稻谷及副产物深加工国家工程实验室,长沙 410201)

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，在农作物中主要是以AFB1、AFB2、AFG1及AFG24种形式存在。黄曲霉毒素具有致癌、致畸和引起肝脏损伤的作用[1-2]，世界卫生组织(WHO)癌症研究机构已将其确定为1类致癌物，世界各国和地区均对其在各类食品中制定了限量标准[3-5]。因此，为实现食品中黄曲霉毒素的有效监管，确保食品安全，对食品中黄曲霉毒素进行准确检测显得十分关键。

目前，黄曲霉毒素准确定量的方法主要有柱后光化学衍生HPLC法[6]、柱后碘衍生HPLC法[7]及无衍生UPLC法[8]等。柱后光化学衍生HPLC法无需特殊的化学试剂，在线衍生，操作简单，易进行批量样品的检测；柱后碘衍生HPLC法检测灵敏度高；无衍生UPLC法因采用高压泵、色谱柱小颗粒技术和高灵敏度荧光检测器，从而无需衍生，AFB1和AFG1均能被检测、定量，其耗时短、流动相用量少、进样量低。由于植物油中黄曲霉毒素含量低，并且存在基质干扰现象，常采用免疫亲和柱净化等净化方法[9-11]处理样品。免疫亲和柱净化是采用上样、纯甲醇洗脱的方式，由于洗脱液中有机相比例过高，常采用氮吹的方法挥去过多的有机溶剂，再用流动相复溶。在氮吹过程中，黄曲霉毒素也可能挥发，从而造成样品测定值偏低[12]，且氮吹过程耗时。

因此，本文对样品的前处理条件进行改进，采用不氮吹和50%甲醇溶液进样，采用柱后光化学衍生HPLC法、柱后碘衍生HPLC法及无衍生UPLC法，在改进的色谱条件下同时检测植物油中4种黄曲霉毒素的含量，并从线性关系、检出限、准确度、精密度、实际样品检测等方面对这3种改进方法进行了分析和比较，以探讨其对植物油中黄曲霉毒素检测的适用性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄曲霉毒素混合标准物质(Sigma公司)，黄曲霉毒素B1/B2/G1/G2免疫亲和柱(北京华安麦科生物技术有公司)，乙腈、甲醇为色谱纯(德国默克公司)，超纯水，阳性花生油(国家粮食和物资储备局比对考核样)，大豆油(黄曲霉毒素未检出，市售)，氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，Whatman 934-AH微纤维滤纸。

Agilent 1260高效液相色谱仪(配荧光检测器、自动进样器，美国Agilent公司)，Waters acquity UPLC 超高效液相色谱仪(配荧光检测器、自动进样器，美国Waters公司)，光衍生器(230 V, 50 Hz,8 W,美国Aura Industries公司 )，柱后碘衍生系统(美国Waters公司)，明澈-D24uv超纯水机。

1.2 试验方法

1.2.1 混合标准工作液的配制

取质量浓度为0.28 μg/mL AFG2、0.88 μg/mL AFG1、0.32 μg/mL AFB2、1.02 μg/mL AFB1混合标准储备液，并将其稀释配成质量浓度分别为梯度1 (0.14 ng/mL AFG2、0.44 ng/mL AFG1、0.16 ng/mL AFB2、0.51 ng/mL AFB1)、梯度2 (0.28 ng/mL AFG2、0.88 ng/mL AFG1、0.32 ng/mL AFB2、1.02 ng/mL AFB1)、梯度3 (0.56 ng/mL AFG2、1.76 ng/mL AFG1、0.64 ng/mL AFB2、2.04 ng/mL AFB1)、梯度4 (1.40 ng/mL AFG2、4.40 ng/mL AFG1、1.60 ng/mL AFB2、5.10 ng/mL AFB1)、梯度5 (2.80 ng/mL AFG2、8.80 ng/mL AFG1、3.20 ng/mL AFB2、10.20 ng/mL AFB1)、梯度6 (4.20 ng/mL AFG2、13.20 ng/mL AFG1、4.80 ng/mL AFB2、15.30 ng/mL AFB1)、梯度7 (5.60 ng/mL AFG2、17.60 ng/mL AFG1、6.40 ng/mL AFB2、20.40 ng/mL AFB1)的混合标准工作液，且标准工作液使用50%甲醇定容。

1.2.2 改进的样品前处理

称取试样(5 .00 g)→加入氯化钠(1.0 g)→加入甲醇水溶液提取液(25 mL，体积分数70%)→涡旋混匀→摇床浸提(200～ 300 r/min， 20 min)→离心分离(4 000 r/min， 5 min)→取上层清液(10 mL)→加入去离子水稀释(20 mL)→涡旋混匀→微纤维滤纸过滤→收集滤液→免疫亲和柱净化(15.0 mL)→去离子水洗涤(10 mL/次，2次)→甲醇洗脱(1.0 mL)→收集洗脱液→水稀释定容至2.0 mL→微孔滤器过滤(0.22 μm)→高效液相色谱分析。

1.2.3 改进的色谱条件(见表1)

表1 3种分析方法的优化色谱条件

2 结果与讨论

2.1 柱后衍生和无衍生的比较

取质量浓度为梯度5 (2.80 ng/mL AFG2、8.80 ng/mL AFG1、3.20 ng/mL AFB2、10.20 ng/mL AFB1)的混合标准工作液，按照1.2.3色谱条件进行测定，4种黄曲霉毒素的谱图见图1、图2。阳性花生油样按照1.2.2进行样品前处理，按照1.2.3色谱条件进行测定，4种黄曲霉毒素的谱图见图3。

图1 无衍生UPLC法测定4种黄曲霉毒素的谱图(梯度5)

图2 两种衍生HPLC法测定4种黄曲霉毒素的谱图(梯度5)

由图1可见，无衍生UPLC法的4种黄曲霉毒素均能在5 min内分离，且分离度较好，但仍存在AFB1、AFG1的荧光强度低于AFB2、AFG2，但不影响其定量的要求。由图2可见，柱后光化学衍生HPLC法和柱后碘衍生HPLC法都能提高AFB1、AFG1的荧光强度，柱后碘衍生HPLC法尤其突出，且4种黄曲霉毒素均能达到较好的分离与定量。总之，柱后光化学衍生HPLC法能在线衍生、操作简便，适合处理大批量样品，柱后碘衍生HPLC法检测灵敏度高，无衍生UPLC法适用于植物油中黄曲霉毒素的快速定量测定。由图3可见，采用前处理不氮吹、50%甲醇溶液环境下直接上样，进行液相色谱分析，花生油样中4种黄曲霉毒素均能较好地被分离、定量，同时节省了时间。

图3 阳性花生油样中4种黄曲霉毒素的谱图(柱后碘衍生HPLC法)

2.2 线性关系和检出限的比较

按照1.2.1取AFG2、AFG1、AFB2和AFB17个梯度的标准工作液，按1.2.3色谱条件进样测定，每个质量浓度梯度进样3次。以峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标，考察4种黄曲霉毒素的线性范围，并以S/N=3、S/N=10分别为4种黄曲霉毒素的检出限和定量限，结果见表2。从表2可见：柱后光化学衍生HPLC法4种黄曲霉毒素的相关系数均大于0.999 9，柱后碘衍生HPLC法的相关系数均大于0.999 8，无衍生UPLC法的相关系数均大于0.997 1，可见3种方法测定4种黄曲霉毒素的标准曲线线性关系均良好；柱后碘衍生HPLC法的检出限和定量限最低，无衍生UPLC法的最高，充分验证了柱后碘衍生HPLC法具有较高的检测灵敏度，但3种方法均能满足检测的需求。

表2 不同方法中4种黄曲霉毒素的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.3 回收率和精密度的比较

将大豆油样品分成3份，其中1份作本底，另外2份分别加入按1.2.1配制的梯度2混合标准工作液14.0 μL和60.0 μL，按照本文改进的方法进行处理和测定，每份样品进行6次平行测定，考察方法的回收率和精密度，结果见表3。从表3可见，3种分析方法测得加标回收率为90.7% ～ 116.1%，相对标准偏差小于12%，表明3种方法准确性良好。

表3 不同方法大豆油中4种黄曲霉毒素的加标回收率和相对标准偏差(RSD)(n=6)

2.4 实际样品检测的比较

利用已改进的3种检测分析方法对考核花生油样进行3次平行测定，结果取平均值，见表4。由表4可看出，3种方法均能准确地测定花生油中4种黄曲霉毒素的含量，与其比对考核验证结果一致。

表4 不同方法中实际样品4种黄曲霉毒素 检测结果的比较 μg/kg

3 结 论

经过优化样品前处理和色谱条件，采用柱后光化学HPLC法、柱后碘衍生HPLC法及无衍生UPLC法测定了植物油中4种黄曲霉毒素的含量并进行了比较研究。结果发现：采用前处理不氮吹、50%甲醇溶液环境下直接上样进行液相色谱分析，油样中4种黄曲霉毒素均能被较好分离、定量，并简化了前处理过程。柱后光化学衍生HPLC法、柱后碘衍生HPLC法及无衍生UPLC法中AFB1的检出限分别为0.035、0.018、0.045 μg/kg，AFB2的检出限分别为0.016、0.014、0.017 μg/kg，AFG1的检出限分别为0.067、0.024、0.080 μg/kg，AFG2的检出限分别为0.029、0.026、0.029 μg/kg；3种分析方法线性关系良好(r2>0.99)，回收率为90.7%～116.1%，相对标准偏差低于12%；3种分析方法测得花生油样品中4种黄曲霉毒素的含量基本一致；柱后光化学衍生HPLC法易于批量样品检测，柱后碘衍生HPLC法检测灵敏度高，无衍生UPLC法检测耗时短，3种方法能够满足粮油检测工作的需要，具有实际应用价值。