他汀类药物代谢相关ApoE基因多态性与冠状动脉介入术后再狭窄的相关性研究

范春煜，苏昊，付强，苏琦，夏霏，刘海涛

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是目前临床上最重要的血运重建的一线治疗方案，大大降低了冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者的死亡率[1]，尤其是近几年药物涂层支架的广泛使用，更是将术后再狭窄率控制在10%以内[2]，但术后支架内再狭窄（ISR）仍然是影响患者长期预后最关键的因素。因此，尽早预测PCI后ISR，并在术前积极辅以阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板药物，以及强化他汀类降血脂药物对于预防PCI围手术期不良心血管事件的发生尤为重要。目前普遍认为，高胆固醇血症是PCI后再狭窄的主要危险因素之一[3]。因此，从遗传学角度寻找血脂代谢相关基因对于解释PCI后发生ISR个体差异性提供了新的思路[4]。载脂蛋白E（ApoE）基因是调节血脂代谢的关键基因，其含有三个等位基因（ε2、ε3和ε4）和六种表型（ε2/2、ε3/3、ε4/4和ε2/3、ε2/4、ε3/4）[5]，但是，目前鲜少见有研究讨论ApoE基因多态性与ISR发生的相关性。因此，笔者在汉族人群中进行了大样本ApoE基因多态性研究，所有患者在首次入院时均进行他汀类药物代谢相关基因检测，分析PCI后患者再狭窄与ApoE基因多态性的关系，为PCI患者优化他汀类药物降脂治疗提供一定的临床依据。现研究报告如下：

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究选取2016年1月至2018年5月期间于辽宁省人民医院心血管内科行PCI的615例患者为研究对象，其中男性429例，女性186例，年龄42～80岁，平均年龄（61.78±8.45）岁。入选标准：①在本地居住20年以上的汉族患者；②由2位介入专家进行冠状动脉（冠脉）造影，所有患者均确诊为急性冠脉综合征（ACS），包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不稳定型心绞痛；③行PCI的标准均为血管狭窄≥75%；④PCI前规范服用阿司匹林和氯吡格雷抗血小板药物；⑤既往未接受过PCI治疗；⑥所有患者均完成ApoE基因测序；⑦获得患者及家属对本项研究的知情同意并签署知情同意书。排除标准：①不符合上述纳入标准的患者；②患者在治疗前出现严重的意识障碍、心力衰竭、伴有严重的肝肾功能不全、恶性肿瘤、血液系统疾病、急慢性感染或伴有严重出血倾向者；③预计生存时间≤1年者；④相互间有血缘关系者；⑤精神障碍不能合作者、依从性差者、失访者、自愿退出研究者等。本项研究获本院伦理委员会批准。

1.2 方法 收集患者的一般临床资料：包括年龄、性别、体质指数（BMI）、心率（HR）、平均收缩压（SBP）、平均舒张压（DBP）、疾病史、吸烟史等。所有患者视自身病情给予抗血小板药物（阿司匹林和氯吡格雷）、硝酸酯类药物、降压药物等常规治疗。并于入院开始服用阿托伐他汀钙（商品名立普妥，上海辉瑞制药有限公司生产，10 mg/片）20 mg，1/d，睡前口服。持续治疗12个月。

1.2.1 实验分组 所有患者完成PCI术后随访1年，复查冠脉造影，根据国际Mehran标准[6]，判断是否出现ISR。若支架内或支架两端5 mm内的血管内径狭窄≥50%，则判定为ISR。将所有患者分为ISR组和非ISR组，其中72例复查冠脉造影后确诊为ISR，即为ISR组。其余543例为非ISR组。ISR组中男性44例，女性28例，年龄44～80岁，平均年龄（62.86±8.79）岁；非ISR组中男性385例，女性158例，年龄42～80岁，平均年龄（61.18±7.52）岁。

1.2.2 血液样本采集 采集所有受试者清晨空腹时的外周静脉血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二钠（EDTA-Na）抗凝剂的采血管中，用于检测生化指标；其余血液样本于-70℃低温保存，用于进行DNA提取。

1.2.3 血常规检查 采用SYSMEX XS-800i全自动血液生化分析仪（日本希森美康公司）检测血生化指标。严格按照仪器操作手册进行操作，所有检测在2 h内完成。包括三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），另外采用口服葡萄糖耐量试验检测空腹血糖值（FPG）。采用糖化血红蛋白仪（美国Bia-rad 公司）测定糖化血红蛋白（HbA1c）。

表1 两组患者一般情况比较（n，%）

1.2.4 基因多态性检测方法 ①采用Primer Express软件（美国Applied Biosystems公司）设计引物和探针，由上海生工生物工程有限公司合成并提供。②外周血白细胞DNA提取：采用基因组DNA小量抽提试剂盒（由北京天根生物技术有限公司提供）。具体提取方法参照说明书进行。采用紫外分光光度法测定DNA质量和浓度。③进行PCR-RELP：取8 μl PCR扩增产物，加入2 μl 10×Buffer和1 μl特异性限制性内切酶（购自大连宝生生物工程有限公司），然后加入9 μl去离子水，于37℃反应12～14 h。④将PCR产物进行电泳检测。⑤基因测序：将50 μl测序样品送至上海生工生物工程有限公司进行纯化测序；选择ApoE基因的两个脆性位点，即112位半胱氨酸TGC和158位精氨酸CGC。进行大批量扩增，电泳，酶切，确定基因型。根据魏法权等[7]学者提出的分类方法，将ApoE（*2，*4）各代谢表型分为三组，ApoE（*2）TT/ ApoE（*4）TT为他汀类药物快代谢型，ApoE（*2）CC/ ApoE（*4）TT为正常代谢型，其余基因型为慢代谢型。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行处理分析。计量资料以均数±标准差（）表示，计量资料间两组均数比较采用t检验。计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素二元Logistic回归分析计算优势比（OR）及其95%可信区间表示ISR的相对危险度。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床基线资料比较 随访1年后，将支架内或支架两端5 mm内的血管内径狭窄≥50%定义为ISR。ISR组患者血清LDL-C水平、糖尿病史及高脂血症病史比例高于非ISR组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组患者其他临床资料和病理特征基本一致，未见统计学差异（P＞0.05）（表1）。

2.2 基因型分布 本项研究中，所有患者ApoE（*2，*4）位点基因型检出率为100%。93例（15.1%）为快代谢型，482例（78.4%）为正常代谢型，40例（6.5%）为慢代谢型。ISR组有13例患者（18.1%）为慢代谢型，慢代谢型患者比例明显高于非ISR组（5.0%）（P＜0.05）（表2）。

表1 患者的一般临床资料、生化指标及病理特征分析[（），（n，%）]

表1 患者的一般临床资料、生化指标及病理特征分析[（），（n，%）]

注：IRS：术后支架内再狭窄；BMI：体质指数；HR：心率；SBP：收缩压；DBP：舒张压；HbAlc：糖化血红蛋白；FPG：空腹血糖；TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

项目 IRS组（n=72）非IRS组（n=543）t/χ2值P值年龄/（岁） 62.86±8.79 61.18±7.52 1.745 0.082男性（n，%） 44（56.9） 385（71.5） 2.889 0.089 BMI（kg/m2） 23.11±0.72 22.98±0.68 1.514 0.131 HR（次/min） 70.15±9.13 68.32±9.04 1.612 0.107 SBP（mmHg） 145.18±15.33 140.91±18.02 1.920 0.055 DBP（mmHg） 95.21±7.46 93.85±6.41 1.658 0.098 HbAlc（%） 5.57±0.76 5.46±0.87 1.022 0.307 FPG（mmol/L） 6.19±1.24 6.14±1.17 0.338 0.735 TG（mmol/L） 1.92±0.41 1.87±0.35 1.115 0.265 TC（mmol/L） 4.60±1.43 4.41±1.28 1.167 0.244 HDL-C（mmol/L） 1.22±0.18 1.26±0.19 1.689 0.092 LDL-C（mmol/L） 2.79±0.73 2.61±0.61 2.296 0.022糖尿病史（n，%） 21（29.2） 103（19.0） 4.107 0.043高血压史（n，%） 52（72.2） 347（63.9） 1.930 0.165高脂血症史（n，%） 40（63.9） 235（43.3） 3.876 0.049吸烟史（n，%） 10（13.9）c 51（9.4) 1.439 0.230血管狭窄支数（n，%） 1.911 0.385单支 27（37.5） 205（37.8） - -双支 29（40.3） 181（33.3） - -≥3支 16（22.2） 157（28.9） - -支架数量 1.78±0.64 1.65±0.60 1.714 0.087支架直径（mm） 2.75±0.42 2.71±0.49 0.661 0.509术前狭窄程度（%） 84.90±5.17 83.75±5.36 1.718 0.086

2.3 代谢基因多态性与血脂变化的关系研究 所有患者服用阿托伐他汀钙12 w后，复查血脂指标。快代谢型、正常代谢型和慢代谢型患者TG、TC和LDL-C较基线值均有不同程度的下降，而慢代谢型患者TC和LDL-C下降幅度最低，与其他两组患者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。而快代谢组患者TG、TC和LDL-C下降幅度与正常代谢组患者相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。三组患者HDL-C较基线值有所上升，但是三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

2.4 基因型对再狭窄发生的影响 以ISR（无=0，有=1）作为因变量，基因型（快代谢型=1，正常代谢型=2，慢代谢型=3）作为自变量，以LDL-C（正常=0，异常=1）、糖尿病史（无=0，有=1）、高脂血症史（无=0，有=1）、支架直径（＜3 mm=0，≥3 mm=1）为协变量，进行二分类Logistic回归分析，探讨基因表型对再狭窄发生的影响。将慢代谢型为参考标准，快代谢为基因表型（1），正常代谢型为基因表型（2）。结果显示，快代谢型的患者发生再狭窄的危险性是慢代谢型的0.142倍，正常代谢型的患者发生再狭窄的危险性是慢代谢型的0.214倍。即相对于慢代谢型来说，快代谢型和正常代谢型可能是再狭窄发生的独立保护因素，且快代谢型的危险性低于正常代谢型。同样，LDL-C、糖尿病史、高脂血症史、支架直径都可能是支架内再狭窄发生的独立影响因素（表4）。

表2 受试对象的等位基因和基因型分布（n，%）

表3 不同代谢型患者血脂水平较基线值变化

表3 不同代谢型患者血脂水平较基线值变化

注：TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；与快代谢组比较，aP＜0.05；与正常代谢组比较，bP＜0.05

项目 快代谢（n=93）正常代谢（n=482）慢代谢（n=40）F值 P值TG（mmol/L） -0.31±0.24 -0.31±0.27 -0.29±0.26 0.11 0.899 TC（mmol/L） -1.87±0.49 -1.82±0.47 -1.38±0.37ab 21.22 0.000 HDL-C（mmol/L） 0.14±0.20 0.11±0.19 0.10±0.16 1.09 0.337 LDL-C（mmol/L） -1.48±0.17 -1.45±0.15 -1.19±0.20ab 54.80 0.000

表4 二分类Logistic回归分析结果

3 讨论

冠心病死亡率和致残率较高，病因复杂，给患者家庭增加了极大的经济负担。而急性冠脉综合征是导致冠心病患者死亡的重要原因之一，与冠脉不稳定斑块破裂迅速形成血栓密切相关[8]。斑块一旦破裂，血小板迅速聚集并大量黏附纤维蛋白形成血栓[9]。目前对于ACS患者的治疗，首先需尽快恢复冠脉血流灌注，除常规药物治疗外，PCI已成为冠心病领域干预不稳定斑块最主要的措施之一[10]。近几年，随着医疗水平的飞速发展，PCI的适应症越来越广泛，尤其是药物洗脱支架和生物可吸收支架的出现，进一步改善了患者预后，但是依旧无法从根本上逆转心肌缺血性损伤，部分患者仍可能发生支架内再狭窄。因此早预测、早干预对于改善患者PCI的预后具有重要的临床价值。

目前，关于ISR形成机制尚不明确，Hey等[11]学者认为支架内血栓形成是导致ISR的重要因素。因此，研究支架内血栓形成的相关因素对于减少支架再狭窄的发生风险具有积极的意义。除已发现的一些炎性分子以外，从遗传学角度分析ISR发生的个体差异性成为近几年医学界探讨的热点。血脂代谢异常，特别是血清TC、LDL-C水平升高与支架内血栓形成密切相关[12]。因此，血脂管理是PCI后防止ISR发生的重要措施。他汀类药物属于羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂，可明显降低外周血TC和LDL-C水平，是PCI前广泛使用的调脂药物之一[13]，因此，患者对于他汀类药物的反应性是否良好是影响ISR的发生风险的重要环节。早在上个世纪末，就有学者提出，ApoE基因多态性与血脂代谢密切相关[14]，但是直到近两年，才逐渐有研究证实，ApoE基因是参与他汀类药物代谢的关键基因，并且与调控外周血TC和LDL-C水平有关。Liang等[15]观察ApoE不同等位基因携带者的血脂水平，发现存在差异，推测ApoE可能是影响血脂水平的关键基因。Wu等[16]则选取了85岁以上的人群进行观察研究，研究发现，ApoE基因多态性对心脑血管事件的发生有影响。根据氨基酸的不同，ApoE基因可分为ApoE2、ApoE3、ApoE4三个亚型，虽然每个亚型之间仅仅存在一个氨基酸的差异，但是功能却相差甚远。其中ε3等位基因的分布频率最高，而ε2和ε4却属于脆性位点，与血脂代谢密切相关。ε2和ε4属于功能相反的等位基因，ε2可明显降低TC水平，而ε4与高TC、高HDL-C水平有关，可抑制血栓的形成[17]。

本项研究共纳入了资料完整的615例患者作为受试对象，所有患者均因急性冠脉综合征接受PCI。随访1年后，根据冠脉造影结果，将患者分为ISR组和非ISR组。其中ISR组慢代谢型患者比例高于非ISR组，而慢代谢型患者服用阿托伐他汀治疗3个月后，血清TC和LDL-C下降幅度较快代谢型和正常代谢型患者低，其发生原因目前尚未有明确解释，据推测，可能与不同的ApoE 基因亚型与脂蛋白受体的结合能力存在差异有关。魏法权等[7]学者曾明确证实，ApoE基因多态性与他汀类药物的治疗效果密切相关，尤其是ε2等位基因携带者预后更佳。并且通过药物分层分析发现，口服等剂量阿托伐他汀后，ε2等位基因携带者LDL-C和TC水平降低更为明显。但是，国外有学者却发现，ε4等位基因和ε2等位基因对血脂水平的影响正好相反[18]，且ApoE4基因与脂蛋白受体的结合能力相对更高[19]。ε2等位基因携带者的TC、LDL-C最低，ε4等位基因携带者TC、LDL-C最高。从机制方面分析，可能是由于ApoE4优先与极低密度脂蛋白受体结合，这与N端112位的Cys-Arg的置换有关；可使血清中极低密度脂蛋白水平降低，反馈性调节LDL受体数目，减缓LDL-C分解代谢，促使血清LDL-C水平升高；而ApoE2优先与HDL受体结合，促使胆固醇清除，从而降低血清TC水平[20]。因此，本项研究初步得出的结论为快代谢型患者PCI后再狭窄发生率最低，而慢代谢型患者PCI后再狭窄发生率最高。通过多因素二分类Logistic回归分析结果显示，相对于慢代谢型来说，快代谢型和正常代谢型可能是再狭窄发生的独立保护因素，且快代谢型的危险性低于正常代谢型。

综上所述，对于服用他汀类药物治疗的PCI患者，其他汀类药物代谢相关基因多态性与患者术后发生支架内再狭窄的风险密切相关，通过常规检测ApoE基因分型，进而调整用药方案（如加大用药量，换用其他类型调血脂药物）有可能改善预后，减少支架内再狭窄的发生。