牛奶中5-HMF的RP-HPLC测定方法优化

赵悦 李林强 牛鹏飞

关键词：牛奶;5-羟甲基糠醛（5-HMF）;反相高效液相色谱

中图分类号：TS252文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）03-0798-03

Optimization of reverse-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC） method for determination of 5-hydroxymethylfurfural in milk

ZHAO Yue，LI Lin-qiang，NIU Peng-fei

（College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian 710100， China）

Key words： milk;5-hydroxymethylfurfural（5-HMF）;reverse-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）

在人类生命的各个阶段，乳制品均是饮食的重要组成部分，对骨骼和牙齿的生长发育具有重要作用。牛奶中的营养极为丰富[1]，但在热处理过程中，因热诱导而产生的化学反应可能会影响其品质。美拉德反应就是牛奶加热过程中常见的一种化合反应[2]。5-羟甲基糠醛（5-HMF）是含有碳水化合物的食物在热处理期间发生美拉德反应形成的Amadori化合物之一[3]。影响5-HMF在食品中生成的因素有碳水化合物含量、热处理、水分活度、贮藏时间和包装等[4-5]。目前的研究大多集中于将5-HMF作为筛选低乳糖牛奶褐变抑制剂的标示物。Durling等[6]指出HMF是一种DNA损伤剂。5-HMF还可以代谢成5-磺基甲基糠醛（5-SMF），这是一种可以与DNA结合并引起诱变效应的活性中间体。由此可见，5-HMF和5-SMF都是小鼠肠道的致癌物质[7]。通常认为，5-HMF对神经系统有害[8]，它与蛋白质结合，从而导致体内毒物的积累，并具有强大的生殖毒性[9]，同时也会损伤横纹肌和内脏[10]。许多国家已经开始严格限制蜂蜜、啤酒和葡萄糖注射液中5-HMF的质量浓度[11]。检测牛奶中5-HMF质量浓度也十分重要。有学者开发了一种比色法，用于测定乳制品中5-HMF的质量浓度[12]。目前常用的5-HMF检测方法有分光光度法[13]、毛细管电泳法[14]、胶束电动毛细管色谱法[15]和高效液相色谱（HPLC）法[16]等，其中最为常用的是高效液相色谱法。虽然中华人民共和国农业农村部对奶制品中5-HMF质量浓度的HPLC检测法（标准方法）[17]有所规定，但在试验过程中需添加较多的化学试剂，前处理步骤较为繁琐，而且复杂的基质也会造成目标物与牛奶成分的共洗脱以及保留时间的变化，导致检测结果不稳定，因此有必要从方法学上对其样品前处理方法进行优化。5-HMF的HPLC检测常用的样品前处理方法有草酸法[18]、三氯乙酸法[19]、冰乙酸法[20]和乙腈法[21]等。本研究拟基于反相高效液相色谱（RP-HPLC）法建立一种可以对牛奶中5-HMF进行定量分析的方法，以期为牛奶中5-HMF质量浓度的检测提供简便、快速、准确的方法。

1材料与方法

1.1材料

本研究所用液态牛奶购于当地超市，纯度为99%的5-HMF标准品购自上海北诺生物科技有限公司，甲醇和乙腈（色谱纯），购自Fisher公司，三氯乙酸、乙酸锌、亚铁氰化钾、草酸和冰乙酸均为国产分析纯。

1.2仪器

本研究所用主要仪器有：U-3000型高效液相色谱系统（热电公司产品）、DiamonsilTM型二代C18色谱分析柱（DIKMA有限公司产品）、SHZ-III型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂产品）、AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品]、MX-F型旋涡混匀器（上海圣科仪器设备有限公司产品）、TG16-WS型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品）。

1.3方法

1.3.1RP-HPLC色谱条件色谱柱为DiamonsilTM型二代C18色谱分析柱，进样量10 μl，流速1 ml/mim，柱温30 ℃，洗脱时间30 min，检测波长280 nm。流动相A为5%甲醇+95%超纯水，流动相B为100%甲醇。洗脱梯度：流动相A∶流动相B=96∶4（体积比）。

1.3.2标准曲线

1.3.2.1标准储备溶液的制备准确称取10 mg 5-HMF标准品，加入甲醇溶解后，转移至100 ml容量瓶中，用甲醇定容，混合均匀后配制成100 mg/L的5-HMF标准储备溶液，并将其存储在4 ℃冰箱中备用。

1.3.2.2标准曲线的建立取5-HMF标準储备溶液，将其配制成质量浓度分别为0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的5-HMF标准溶液，采用外标法，按1.3.1中的色谱条件进样分析。以峰面积为Y轴，以5-HMF的质量浓度为X轴绘制标准曲线。

1.3.3精密度测试对质量浓度为20 mg/L的5-HMF标准溶液分2批次进样，每批3针，共计6针。第一批进样结束后，标准溶液在4 ℃冰箱中放置过夜后再进行第2批进样。统计6针进样的保留时间、峰高和峰面积，分别计算其相对标准偏差（RSD）。

1.3.4牛奶前处理准确量取197 ml牛奶置于烧杯中，加入3 ml 100 mg/L 5-HMF标准溶液，配制成5-HMF质量浓度为1.5 μg/ml的牛奶。用三氯乙酸法、冰乙酸法、乙腈法和标准方法进行牛奶前处理，每种方法重复3次。

1.3.4.1三氯乙酸法取10 ml牛奶样品置于25 ml试管中，加入1 ml 50%三氯乙酸溶液，旋涡1 min混匀，静置10 min，转移至离心管，6 000 r/min离心10 min。取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，按方法1.3.1中的色谱条件进样分析。

1.3.4.2冰乙酸法取10 ml牛奶样品置于25 ml试管中，加入1 ml冰乙酸后，旋涡1 min混匀，静置10 min，转移至离心管，6 000 r/min离心10 min。取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，按方法1.3.1中的色谱条件进样分析。

1.3.4.3乙腈法取10 ml牛奶样品置于烧杯中，加入20 ml乙腈，剧烈振荡20 min，取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，按方法1.3.1中的色谱条件进样分析。

1.3.4.4标准方法取10 ml牛奶样品置于25 ml试管中，加入5 ml 0.15 mol/L草酸，旋涡混匀，转移至50 ml容量瓶中，用约10 ml甲醇分次淋洗试管，使样品完全转移。然后加入3 ml 92 g/L亚铁氰化钾溶液、3 ml 183 g/L乙酸锌溶液，剧烈振荡后静置15 min，加甲醇定容至50 ml，旋涡1 min混匀，静置10 min，转移至离心管，6 000 r/min离心10 min。取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，按方法1.3.1中的色谱条件进样分析。

1.3.5加标回收率准确量取10 ml牛奶置于25 ml试管中，分别添加0.10 mg、0.20 mg和0.40 mg 5-HMF（每个水平重复6次），按方法1.3.4.1中的方法处理样品，按方法1.3.1中的色谱条件进样分析，以衡量不同水平下目标组分的加标回收率。

1.3.6灵敏度以3倍信噪比测试5-HMF的检出限（LOD），以10倍信噪比测试5-HMF的定量限（LOQ）。

2结果与分析

2.1标准曲线

对标准样品进行RP-HPLC测定，结果表明，5-HMF标准溶液在280 nm处有响应，分离效果明显。以峰面积为Y轴，5-HMF的质量浓度为X轴，绘制标准曲线。5-HMF质量浓度为0～100 mg/L时，线性关系良好（R2=0.998）。回归方程：Y=1.312x+0.083。可以看出，5-HMF质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系。因此，采用峰面积定量法对5-HMF进行定量分析是可行的。

2.2精密度

按照方法1.3.1中的方法对质量浓度为20 mg/L的5-HMF标准溶液连续进样6次，记录保留时间、峰高和峰面积数据。对数据进行分析可知，保留时间、峰高和峰面积的RSD均小于2%。因此，RP-HPLC法对5-HMF的检测结果符合要求，U-3000型高效液相色谱系统的精密度良好，适用于定量分析。

2.3牛奶前处理方法的优化

采用4种不同的样品前处理方法对牛奶进行前处理，其中三氯乙酸法、冰乙酸法和标准方法均是通过加酸改变蛋白质构象，使蛋白质變性沉淀，再离心除去沉淀，取上清液用于5-HMF质量浓度的检测。乙腈法是通过有机溶剂破坏蛋白质自身的氢键从而使蛋白质变性沉淀，再对5-HMF的质量浓度进行检测。

除乙腈法外，其他3种方法分离出的目标峰均能与干扰峰达到基线分离。三氯乙酸法处理后，样品的色谱峰较理想。牛奶通过不同前处理后检测到的5-HMF质量浓度由高到低为：三氯乙酸法>乙腈法>冰乙酸法>标准方法，其中标准方法的RSD为5%，其他3种方法的RSD均小于4%。三氯乙酸法处理的样品中检测到的5-HMF质量浓度最高，标准方法处理的样品中检测到的5-HMF质量浓度最低，分别为1.36 μg/ml和0.57 μg/ml。三氯乙酸法、冰乙酸法、乙腈法、标准方法处理1个样品所需的时间分别为25 min、25 min、30 min和45 min，三氯乙酸法和冰乙酸法用时最短，标准方法用时最长。在试剂用量上，三氯乙酸法和冰乙酸法的试剂用量最少，只需1 ml，标准方法试剂用量最大，需要40 ml。总之，三氯乙酸法相较与标准方法更加快速、准确，并且试剂用量少，因此采用三氯乙酸法对样品进行前处理。

2.4加标回收率

按方法1.3.5中的方法进行加标回收率测试。在10 ml牛奶中添加5-HMF后，样品中的目标峰明显增大。随着5-HMF添加量的增加，其加标回收率增加，添加0.10 mg、0.20 mg和0.40 mg 5-HMF的加标回收率分别为85.65%、93.34%和100.95%，其RSD分别为1.62%、1.31%和0.66%。说明，RP-HPLC法的准确性好，稳定性高，可行性强，适合用于牛奶中5-HMF的定量分析。

2.5灵敏度

按方法1.3.6中的方法进行灵敏度检测，结果表明，RP-HPLC法测定牛奶中5-HMF的LOD为0.037 5 mg/L，LOQ为0.069 5 mg/L。

3结论

牛奶在加工处理过程中容易发生美拉德反应从而产生5-HMF，5-HMF具有一定毒性，因此建立一种可以快速、准确检测牛奶中5-HMF的方法至关重要。本试验采用RP-HPLC法对牛奶中5-HMF的质量浓度进行测定，并在前人研究的基础上对牛奶前处理的方法进行了优化。其中，三氯乙酸法处理后样品的目标峰出峰明显，峰型理想，检测到的5-HMF质量浓度最高，并且样品前处理时间最短，试剂用量最少。采用三氯乙酸法对样品进行前处理，然后用RP-HPLC法定量检测牛奶中5-HMF的质量浓度，不仅避免了其他方法因试验步骤复杂导致的结果不稳定等问题，还有效缩短了样品处理时间，减少了试剂用量，对奶源的质量控制起到很好的监控作用。

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（責任编辑：王妮）