鱼精蛋白对大肠杆菌急性感染小鼠的保护作用研究

娄欣宇，倪敬轩，林炜明

（1. 龙岩学院 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，福建 龙岩 364012；2. 西南大学 动物科学学院，重庆 荣昌402460；3. 福建农林大学 动物科学学院，福建 福州 350002）

革兰氏阴性菌导致的败血症是目前人类和动物高死亡率的主要病因之一，大肠杆菌（E.coli）作为常见革兰氏阴性菌对人和动物的危害正逐年增加，如大肠杆菌早发性败血症（EOS）是新生儿（尤其是早产儿）死亡的重要原因[1]。近年来致病性E.coli 耐药程度和发病率均呈现上升趋势，病程愈发趋向于急性发作，但人们对其的重视和关注度却有所下降。在对E.coli 的防治上一直受制于理想疫苗和药物的缺乏，而开发高效、快速、安全的药物以提升对大肠杆菌病的防控效果具有重要意义。

病原体侵入机体后，固有免疫系统在早期免疫应答中发挥重要作用，研究发现损伤相关分子模式（DAMP）和病原相关分子模式（PAMP）可以激活受到E.coli 攻击的固有免疫系统，促使机体在感染早期发生强烈的炎症反应[2]，而炎症反应的过度和失控，通常会导致组织损伤和器官衰竭。因此，固有免疫系统能否在抗原侵入早期做出适度的应答，以有效控制病原体的数量和炎症反应，对防控E.coli感染具有十分重要的意义。

鱼精蛋白（PP）是一种主要存在于鱼类成熟精子细胞核中的碱性蛋白质。PP 具有良好的吸附和缓释作用，它可与其它多种蛋白质结合形成不同的蛋白复合物，如能与胰岛素结合，延迟甚至阻止胰岛素的释放，延长其降血糖作用[3]。将抗菌制剂与PP 进行复配，可以在很大程度上延长药效，进而减少药物的用量，降低制药成本[4]。此外，天然提取的PP因成分复杂而具有较强的免疫原性，已有研究表明PP 作为抗原载体可以显著增加小鼠的免疫应答[5]。本实验室的前期研究证明PP 具有快速促进卵清蛋白（OVA）诱导的体液免疫反应的作用，极显著提高E. coli 疫苗的免疫效力[6]，具有良好的临床应用潜力。在此基础上本研究就PP 对E.coli 感染小鼠的早期免疫保护作用进行研究，以期为PP 在临床防治E.coli 急性感染中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料致病性E.coli（CVCC1477）购自中国兽医药品监察所；8 周龄～9 周龄（22 g～24 g）清洁级ICR 雌性小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于IVC 独立送风饲养笼具。硫酸PP购自Sigma 公司；内毒素检测鲎试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；MiniBEST RNA 快速提取试剂盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和TB GreenTMPremix ExTaqTMII（TliRNaseH Plus）试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 E.coli 致死量的确定将50 只雌性ICR 小鼠随机分成5 组，每组10 只。第1～4 组分别腹腔注射E.coli 菌液5×107cfu/0.2 mL/只、1×107cfu/0.2 mL/只、2×106cfu/0.2 mL/只和4×105cfu/0.2 mL/只，第5 组注射等量生理盐水作为空白对照。注射后1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h 观察小鼠的精神状态和死亡情况，计算E.coli 致死量。

1.3 小鼠攻菌保护试验将20 只小鼠随机分为2组，每 组10 只。PP 组 皮 下 注 射PP 100 μg/0.2 mL/只，攻菌对照组皮下注射等体积生理盐水，7 d 后腹腔注射致病性E.coli 菌液0.2 mL（含活菌1×107cfu），连续48 h 观察小鼠发病情况并记录死亡时间。

1.4 攻菌后小鼠外周血、脾脏、肝脏细菌载量的检测将16 只小鼠随机分为2 组，每组8 只。PP 组皮下注射PP 100 μg/0.2 mL/只，攻菌对照组皮下注射等体积生理盐水。7 d 后腹腔注射亚致死剂量E.coli菌液0.2 mL（含活菌2×106cfu）。攻菌后12 h、48 h 采集所有小鼠眼眶静脉血0.2 mL，并于第二次（48 h）采血完成后迫杀，无菌采集部分肝脏、脾脏，研磨后用1 mL PBS 制成组织匀浆，稀释后涂布于LB 琼脂平板，于37 ℃培养，24 h 后进行细菌计数，每个样品3 个重复。

1.5 攻菌后小鼠外周血脂多糖（LPS）、谷丙转氨酶（ALT）含量的检测将24 只小鼠随机分为3 组，每组8 只。PP 组皮下注射PP 100 μg/0.2 mL/只，攻菌对照组和空白组皮下注射等体积生理盐水。7 d 后腹腔注射亚致死剂量E.coli 菌液0.2 mL（含活菌2×106cfu），空白组皮下注射等体积生理盐水。攻菌后分别于12 h、48 h 采集所有小鼠眼眶静脉抗凝血0.2 mL，按照内毒素检测鲎试剂盒说明，利用试管定量显色基质法检测小鼠外周血中LPS 含量；攻菌后48 h 采集所有小鼠眼眶静脉血1 mL，用IDEXX Catalyst One 全自动动物生化分析仪进行血液生化检测，主要检查外周血中ALT 的变化情况。

1.6 攻菌后小鼠脾脏炎症因子mRNA 转录水平的检测实验分组及处理同1.5。攻菌后48 h 迫杀小鼠，无菌取其脾脏（约20 mg）剪碎放入离心管中，采用MiniBEST RNA 快速提取试剂盒提取小鼠脾脏总RNA。调整OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0 的样品RNA 浓度为1 μg/μL，使用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反转录为cDNA，以其为模板，利用ABI Step One Plus 荧光定量PCR仪，以β-actin 为内参基因，检测小鼠脾脏中炎症因子（IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TLR4、NF-κB、IRF3、IRF7）的相对转录水平，结果采用2-ΔΔCT方法进行计算。依据GenBank 收录的序列，应用Primer Premier 5.0 软件设计合成IRF3、IRF7 的特异性引物，其余引物参考文献[7-9]合成（表1）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.7 数据分析试验结果采用SPSS 22.0 统计软件中单因素方差分析和独立样本T 检验进行组间比较；利用Graph Pad Prism 7 软件中Long-rank 进行存活率统计分析。p<0.05 代表组间差异显著；p<0.01代表组间差异极显著。

表1 引物序列表Table 1 The primer sequences

2 结 果

2.1 E.coli 致死量的确定利用小鼠模型确定后续实验中所需致死剂量。结果如图1 所示，当攻菌剂量≥1×107cfu/只时，24 h 内的死亡率为100%；当攻菌剂量为2×106cfu/只时，36 h 内的死亡率为80%；当攻菌剂量为4×105cfu/只时，36 h 内的死亡率为10%（图1）。因此，后续试验分别将1×107cfu/只和2×106cfu/只作为致死剂量和亚致死剂量。

2.2 小鼠攻菌保护试验对小鼠PP 注射7 d 后利用致死剂量E.coli 菌液进行攻菌，结果显示，对照组小鼠感染后4 h 开始发病，临床表现为精神沉郁、呼吸急促、被毛逆立，6 h 开始死亡，28 h 内全部死亡。PP 组小鼠于30 h、36 h 各死亡1 只，其余小鼠逐渐全部恢复，与对照组相比差异极显著（p<0.01）（图2）。表明PP 能够明显增强小鼠对致死性E.coli感染的抵抗力。

图1 不同剂量E.coli 注射对小鼠存活率的影响Fig.1 The effects of different dose of E.coli injection on the survival of mice

图2 攻菌后的小鼠存活率Fig.2 The survival of mice challenged with E.coli

2.3 攻菌后小鼠外周血、脾脏和肝脏的细菌载量PP 注射7 d 后用亚剂量E.coli 菌液给小鼠腹腔注射，检测攻菌后12 h 和48 h 小鼠外周血及其肝脏、脾脏中的细菌载量。结果显示，PP 组小鼠在攻菌后12 h和48 h 时其外周血细菌载量均极显著低于攻菌对照组（p<0.01）。在12 h～48 h 攻菌对照组死亡3 只，PP 组死亡1 只。攻菌后48 h PP 组小鼠脾脏及肝脏中细菌载量均极显著低于攻菌对照组（p<0.01）（图3）。表明PP具有增强机体清除外来E.coli 感染的作用。

图3 攻菌后小鼠外周血（A）、肝脏和脾脏（B）细菌载量Fig.3 The bacterial loads in blood(A),spleen and liver(B)of mice after challenge

2.4 攻菌后小鼠外周血LPS 含量利用试管定量显色基质法检测小鼠外周血中LPS 含量，结果显示，E. coli 攻菌后12 h，攻菌对照组小鼠外周血中LPS 含量极显著高于空白对照组（p<0.01），而PP 组LPS 浓度虽然显著高于空白对照组（p<0.05），却极显著低于攻菌对照组（p<0.01）；E.coli 感染后48 h，攻菌对照组小鼠外周血LPS 浓度仍极显著高于空白对照组（p<0.01），而PP 组LPS 浓度已降至与空白对照组无显著差异（图4）。表明PP 能通过促进机体对E.coli 的清除作用，进而降低攻菌所致小鼠外周血中LPS含量，最终增强小鼠抗E.coli感染的能力。

2.5 攻菌后小鼠外周血中ALT 含量PP 给药7 d 后对小鼠腹腔注射亚剂量E.coli 菌液，检测攻菌后48 h小鼠外周血中ALT 含量。结果显示，攻菌对照组外周血ALT 水平极显著高于空白对照组和PP 组（p<0.01），PP 组ALT 水 平 与 空 白 对 照 组 无 显 著 差 异（p>0.05）（图5）。表明PP能够降低攻菌所致小鼠外周血ALT的升高，提示PP可能具有一定的保护肝脏的作用。

图5 攻菌后48 h 小鼠血液ALT 含量Fig.5 The content of ALT in blood of mice at 48 h after challenge

2.6 攻菌后小鼠脾脏细胞因子mRNA 转录水平PP给药7 d后对小鼠腹腔注射亚剂量E.coli菌液，检测攻菌后48 h 小鼠脾脏中与LPS-TLR4 通路相关的细胞因子的mRNA 转录水平。结果显示，攻菌对照组中IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-10、TLR4、IRF7 的转录水平相较空白对照组均极显著升高（p<0.01）；PP 组中IL-6、TLR4、IFN-β和IRF7的mRNA转录水平相较于攻菌对照组发生了极显著下调（p<0.01），且IL-1β和IL-10 的mRNA 转 录 水 平 发 生 了 显 著 下 调（p<0.05）（图6）。表明当机体受到E.coli 攻击时会引起相关炎症因子的过度表达，而PP 一方面可降低TLR4 及其下游炎症基因的表达，另一方面可下调IRF7 和IFN-β的表达以降低机体对细菌攻击的敏感性，在急性感染早期起到有效控制炎症反应程度的作用。

图6 攻菌后48 h 小鼠脾脏细胞因子的mRNA 转录水平Fig.6 The mRNA transcription of cytokines in the spleen of mice at 48 h after challenge

3 讨 论

攻毒保护率是评价药物抵御病原体攻击能力的重要指标，在感染发生初期抑制病原体侵入的数量和规模对于病程的控制十分重要。E.coli 侵入机体后会迅速进入血液循环并释放LPS 诱发急性炎症反应，而血液、脾脏、肝脏等器官中的细菌载量，以及血液中LPS 含量可以反映机体抵御和清除细菌的能力。肝脏是动物机体最重要的代谢与解毒器官，ALT 是反映肝脏损伤的重要指标，其含量升高程度与肝脏受损呈正相关。本研究结果表明，PP 注射后7 d 对E.coli 急性感染小鼠具有较好的保护作用，这可能与PP 通过增强机体对细菌清除能力，从而有效控制E.coli 感染后的病程发展有关。

LPS 作为E. coli 主要致病因子之一，主要通过LPS-TLR4 通路诱导炎症反应。TLR4 参与组成抗击外来病原的第一道防线[10]，有研究显示TLR4 基因敲除小鼠可以避免死于E. coli 败血症[11]，说明LPS 与TLR4 结合后很可能是LPS-TLR4 上游信号通路的“高危传感器”。NF-κB 是这条通路中重要的下游通路，可调节许多炎症因子和炎症介质的表达，抑制其信号转导能拯救小鼠免于致死性内毒素休克[12]。IL-1β、IL-6 可诱发机体炎症反应，IL-10 能阻断NF-κB 活性，并参与调节JAK-STAT 信号通路。TLR4 可同时启动MyD88 依赖和TRIF 依赖两条信号转导通路，MyD88 可活化转录因子NF-κB 和AP-1引起促炎症基因转录，TRIF 通过激活IRF 家族中的IRF3 和IRF7 诱导Ⅰ型干扰素基因表达。有研究表明IRF3 和IRF7 在对Ⅰ型干扰素的诱导生成中起到相互补充的作用，但后期Ⅰ型干扰素的高表达由IRF7 主导[13]。Ⅰ型干扰素有助于宿主清除病毒，增加宿主对细菌攻击的易感性[14]，但在炎症反应失控时，响应感染产生的Ⅰ型干扰素将会增强LPS 的致死作用，损伤机体[15-16]。本实验结果表明，PP 能够下 调 攻 菌 所 致 的IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-β、TLR4、IRF7 等因子mRNA 转录水平的过度升高，从而在源头上避免早期急性感染期间炎症反应失控和“细胞因子风暴”的发生。

综上所述，PP 能快速诱导小鼠对致病性E.coli的抵抗力，增强机体抵御和清除外来病菌的能力，以保护动物应对E.coli 的早期急性感染。其作用机理与调控LPS-TLR4 通路相关炎症因子的mRNA 转录有关。因此，预防性接种PP 可以通过对机体进行免疫调控以增强动物自身的抗感染能力，使其即便感染也能通过机体自身调整以恢复健康，从而避免抗生素等药物的使用，在一定程度上弥补市面上尚无广谱有效的大肠杆菌疫苗的不足。这值得作为一种新的防治大肠杆菌病的方法进行进一步研究。