祛白片对小鼠B16 脱黑色素细胞模型促黑色素生成的影响

顾红燕，韦元元，卢文超，张 磊，孙路路*

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院药学部，临床合理用药生物特征谱学评价北京市重点实验室，北京 100038； 2.北京大学医学部药学院，北京 100191； 3.首都医科大学药学院，北京 100069）

白癜风是一种常见的获得性色素脱失性疾病，易诊，难治［1-2］。中药制剂祛白片1970 年成方，主要由蒺藜、制何首乌、黑芝麻、补骨脂、丹参、独活等15 味中药组成，以补养肝肾、养血祛风的法则治疗白癜风，具有滋补肝肾，活血通络的功效，临床沿用至今［3-4］，疗效稳定可靠。前期动物实验研究［5］已经证实，祛白片可以促进脱黑色素区域的黑色素色素岛形成，色素岛内可见黑色毛发生长，高通量全基因芯片筛选结果显示祛白片对小鼠6% 的基因转录有影响。由于目前多数研究者认为自身免疫系统亢进是白癜风发病的主要病因［6］，因此本文根据前期研究结果，进一步在细胞和分子水平上研究祛白片促黑色素形成和抗白癜风的作用机制，以弥补传统制剂祛白片基础药理学研究资料不足。

1 材料

1.1 细胞 小鼠B16 黑色素瘤（编号3111C0001CCC00 0324），购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.2 试剂与药物 祛白片浸膏粉由北京世纪坛医院制剂中心中药制剂组自制，主要由蒺藜（炒）、制何首乌、黑芝麻（炒）、补骨脂、女贞子、北沙参等15 味中药组成，批号为京药制字Z20063383。将处方中15 味药材加水煎煮3次，1 h／次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25～130 （50 ℃） 稠膏，真空干燥成干浸膏，得率≥15%，粉碎制成棕褐色粉末状浸膏细粉，内在质量控制方法批号为（2002） 京卫药制字［116］第F-2142 号，采用薄层色谱法进行检验，以供试药品与对照品在相同位置上出现相同颜色斑点判定为合格。阳性对照药8-甲氧补骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP，货号M3501-1G）、过氧化氢（H2O2，货号H1009，100 mL）、左旋多巴 （货号V900425） 均购自美国Sigma 公司；TRNzol 总RNA 提取试剂（货号DP405-02） 购自天根生化科技（北京） 有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （货号RR047B）、SYBR©Premix Ex TaqTMII （Tli RNaseH Plus）、ROX plus （货号RR82LR）、DNA Marker （货号3427Q） 均购自宝日医生物技术（北京） 有限公司；CD4 兔多抗（货号sc-7219，1∶500）、CD8 兔多抗（货号sc-7188） 购自美国Santa cruz 公司；GAPDH 鼠单抗 （货号YM3029，1∶20 000） 购自美国Immunoway 公司；引物合成由美国Invitrogen公司完成。

2 方法

2.1 药物与试剂的配制 祛白片溶液：称取0.1 g 祛白片粉末，加入不含血清的DMEM 培养基培养液溶解至10 mL，0.22 μm 滤膜过滤，样品合格判定标准同内在质量控制方法，采用薄层色谱法进行检验；取经过处理后的祛白片溶液经0.22 μm 滤膜过滤并浓缩后作为供试品溶液，另取补骨脂素等相同处理成对照品溶液，分别点于硅胶G 薄层板上，最终结果以供试药品与对照品相同位置上出现相同颜色斑点判定为合格样品。H2O2溶液：取102.1 μL H2O2原液，加入897.9 μL 培养液，配制成1 mol／L，用培养液稀释到0.1 mmol／L。8-MOP 溶液：取0.216 2 g 8-MOP，加入DMSO 溶解至10 mL，配制成0.1 mol／L，分装-20 ℃保存，使用时，采用无血清DMEM 稀释至所需浓度备用。L-多巴溶液：取1 gL-多巴溶于100 mL PBS 溶液中，磁力搅拌器溶解，配制成10 g／L。

2.2 小鼠黑色素瘤B16 脱黑色素细胞模型建立 制备B16细胞悬液，血球计数板计数，培养液（10% FBS、DMEM、1% P／S） 稀释细胞。96 孔板铺板，每孔10 000 个细胞，5个重复；24 孔板，每孔100 000 个细胞，4 个重复，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。24 h 后更换含0.1 mmol／L H2O2的培养液，与细胞共同孵育4 h［7］，吸弃培养基，即得脱黑色素细胞。

2.3 光镜下观察小鼠B16 黑色素细胞生长状态 分为模型组、溶媒组、8-MOP 组（25、50、100 μmol／L）、祛白片组（25、50、100 μg／mL），模型组细胞造模后加入相同体积的培养基，后续实验与其他组平行；由于8-MOP 由DMSO 溶解配制所得，因此设DMSO 溶媒组，原液稀释1 000 倍，其余操作与实验组平行；阳性对照组（25、50、100 μmol／L）、祛白片组（25、50、100 μg／mL） 分别加入对应药物。于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24、48 h，倒置显微镜下观察脱黑色素瘤细胞形态学变化，并光镜下拍照。

2.4 CCK-8 检测小鼠B16 黑色素瘤细胞存活 取对数生长期B16 细胞，胰酶消化，以细胞浓度为1×104／孔接种于96孔培养板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，根据“2.2”项下方法建立脱黑色素细胞模型，分组同“2.3”项下，另设本底对照组，为不含细胞的本底，仅加入培养基。每组设5 复孔，加入相应药物处理24、48 h，吸去上清，加入CCK-8 （CCK-8∶DMEM＝1∶10） 溶液，放入培养箱中培养4 h，酶标仪测定450 nm 处光密度（OD），细胞存活率＝ ［（OD给药组-OD本底对照组） ／ （OD溶媒组／模型组-OD本底对照组）］×100%［8］，祛白片组细胞存活率计算与模型组比较，8-MOP 组与溶媒组比较。

2.5 黑素形成率测定 用1 mol／L NaOH 裂解法［9］检测，分组同“2.3”项下，加入相应药物处理24、48 h，去除上清液，PBS （pH ＝7.4） 洗2 次，加入200 μL 含10%DMSO 的NaOH 溶液（1 mol／L），80 ℃恒温水浴保温2 h，充分裂解细胞和溶解黑素颗粒，酶标仪检测490 nm 处光密度（OD），黑素形成率＝ ［（OD给药组-OD溶媒组／模型组） ／OD溶媒组／模型组］×100%。祛白片组促黑色素生成计算与祛白片模型相比较，8-MOP 组计算与溶媒组比较。

2.6 酪氨酸酶活性测定 96 孔板接种人黑色素细胞，分组同“2.3”项下，加入相应药物处理24、48 h，弃去培养液，PBS （pH＝7.4） 洗涤2 次，每孔加入1% Triton X-100溶液90 μL，迅速放入-80 ℃冰箱内30 min，随后室温融化使细胞完全破裂，37 ℃预温后加入10 g／LL-DOPA 溶液（100 μL／孔），37 ℃孵育30 min，酶标仪检测490 nm 处吸光度值 （OD）［10］，酪氨酸酶活性促进率＝ ［（OD给药组-OD溶媒组／模型组） ／OD溶媒组／模型组］×100%，正值代表促进酪氨酸酶活性，负值为抑制酪氨酸酶活性。祛白片组酪氨酸酶活性促进率计算与祛白片模型组比较，8-MOP 组计算与其溶媒组比较。

2.7 RT-PCR 检测 各组细胞分别放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后，采用TRNzol 总RNA 提取试剂进行样本RNA 提取，实验操作按产品说明书操作，并采用紫外吸收测定法检测RNA 浓度和纯度，mRNA 逆转录合成cDNA，-70 ℃短暂保存备用。引物序列，CD4 正向5′-GCACAGCTATCACGGCCTAT-3′，反向5′-TTGAGGTCTTTGGTGGACTTTT-3′，190 bp；CD8 正向5′-AGGGGACCGGATTGGACT-3′，反 向 5′-GTGCCATTTTACACAATTTTCTC-3′，199 bp；β-actin 正向5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，反向5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′，150 bp。反应条件为95 ℃、10 s；95 ℃、5 s，55 ℃、20 s，72 ℃、6 s，共40 个循环；95 ℃、1 min，55 ℃、30 s，95 ℃、30 s。采用2-ΔΔct法计算出各目的基因相对表达量。

2.8 Western blot 检测 提取各组细胞总蛋白，BCA 蛋白定量，-70 ℃保存备用。SDS-PAGE 电泳，采用凝胶成像仪进行成像，同时检测各条带灰度值。

2.9 统计学分析 采用SPSS 24.0 软件进行分析，计量资料以（） 表示，重复3 次。若方差齐性，则选用LSD法；若方差不齐，则选用Dunnett T3 法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 祛白片对黑色素细胞生长的影响 由图1 可见，祛白片随着作用时间和剂量的增加，细胞数逐渐增加；作用48 h后，祛白片对脱黑色素细胞促生长作用最明显，8-MOP 给药24、48 h 后，对脱黑色素细胞的促生长作用与祛白片较为类似。

图1 祛白片对脱黑色素细胞生长的影响（×100）

3.2 祛白片对黑色素细胞增殖的影响 如图2 所示，祛白片25、50、100 μg／mL 给药24、48 h 后，细胞存活率逐渐增加，其中50 μg／mL 给药48 h 后为107.33%，100 μg／mL给药48 h 后为114.71%；100 μmol／L 8-MOP 作用于脱黑色素细胞24 h 后，细胞存活率为119.06%。

图2 祛白片对黑色素细胞生长活性的影响

3.3 祛白片对黑色素形成的影响 如图3 所示，50、100 μg／mL祛白片给药24 h 后，促黑色素生成率分别为38.27%、48.44%，100 μg／mL 给药48 h 后为11.79%；100 μmol／L 8-MOP 给药24 h 后促黑色素生成率为11.21%，48 h 后为29.83%。

3.4 祛白片对酪氨酸酶活性影响 由图4 所示，50 μg／mL祛白片作用于脱黑色素细胞24 h 后酪氨酸酶活性促进率为6.92%，25 μg／mL 作用48 h 后为23.37%，100 μg／mL 作用24 h 后为-27.17%，呈抑制作用。

图3 祛白片对促黑色素生成率的影响

图4 祛白片对酪氨酸酶活性的影响

3.5 祛白片对脱黑色素细胞免疫通路mRNA 表达的影响 如表1 所示，祛白片作用于脱黑色素细胞48 h 后，可促进CD4 基因转录，抑制CD8 基因转录 （P＜0.01）；100 μmol／L 8-MOP 作用于脱黑色素细胞后，可促进CD4 基因转录（P＜0.05）。

表1 祛白片对CD4、 CD8 mRNA 表达的影响（， n＝3）

表1 祛白片对CD4、 CD8 mRNA 表达的影响（， n＝3）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 祛白片对脱黑色素细胞免疫通路相关蛋白表达的影响 如表2、图5 所示，100 μg／mL 祛白片作用于脱黑色素细胞48 h 后，可促进CD4 蛋白表达（P＜0.05），抑制CD8蛋白表达（P＜0.01）；100 μmol／L 8-MOP 作用48 h 后，也可促进CD4 蛋白表达（P＜0.05）。

表2 祛白片对CD4、CD8 蛋白表达的影响（， n＝3）

表2 祛白片对CD4、CD8 蛋白表达的影响（， n＝3）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图5 Western blot 检测CD4、CD8 蛋白表达

4 讨论

本研究首先观察祛白片对脱黑色素细胞生长的影响，结果表明，祛白片作用细胞后可随着剂量和作用时间增加而逐渐促进黑色素细胞的生长。在对黑色素生成的影响上，与模型组相比，祛白片（50、100 μg／mL） 给药24 h 后可显著增加黑色素形成，进一步研究祛白片对黑色素合成路径中限速酶酪氨酸激酶活性的影响，结果表明，50 μg／mL祛白片作用于细胞24 h，以及25 μg／mL 作用于细胞48 h时可促进酪氨酸酶活性，而100 μg／mL 作用24、48 h 时没有促进作用，反而呈现明显的抑制作用，表现为双向性调节作用；8-MOP 未出现此现象，50、100 μmol／L 下表现为促进酪氨酸酶的作用。中药双向调节作用是指同一中药及其组成的方剂，在机体不同状态下或以不同的方式应用，可以发挥出趋向相反的作用［11］，因素有很多，如中药本身、中药炮制过程、中药不同部位、剂量等［12］。刘铮等［13］2008年发表的综述中提到有些复方或单味中药对黑色素和酪氨酸活性的影响呈现双向调节作用，作用机制可能与给药剂量有关，但是尚有争议，复方制剂的双向调节作用还有可能与配伍、提取方式、产地、提取方式等有关系。总体来讲，祛白片可促进脱黑色素细胞生长，高剂量情况下作用于脱黑色素细胞24 h 可促进黑色素形成，对酪氨酸酶活性呈现双向性调节作用，表现为低剂量促进酪氨酸激酶活性，高剂量抑制该酶活性。

有研究表明T 细胞依赖性免疫反应参与了白癜风的发病和发展，尤其是在CD8＋T 细胞中，被认为可以直接破坏黑素细胞，辅助性T 细胞，主要是CD4＋T 细胞，可以调节或协助免疫反应，促进白癜风皮损的改善［14］。白癜风患者细胞免疫在一定程度上呈抑制状态［15］，有学者研究显示白癜风患者CD4＋比例显著降低，CD8＋比例显著升高［16-17］，因此本研究进一步探讨了祛白片对CD4、CD8 蛋白及基因表达的影响。由于在黑色素细胞生长、黑色素形成、酪氨酸酶活性3 个实验中发现溶媒组与模型组相比差异均无统计学意义，因此在后续分子生物学实验中未再设溶媒组，阳性对照组结果直接与模型组相比较。结果表明，高剂量祛白片作用于脱黑色素细胞48 h 后可促进CD4 基因转录，抑制CD8 基因转录；8-MOP 高剂量组（100 μmol／L） 作用于脱黑色素细胞后也可显著促进CD4 基因转录，而对CD8影响小。祛白片蛋白表达的研究也得到了相似的结果；100 μmol／L 8-MOP 可增强CD4 蛋白表达，抑制CD8 蛋白表达，对CD4 的作用更显著。综上所述，祛白片可以促进黑色素合成，可能是通过影响自身免疫路径中的CD4、CD8蛋白及基因表达起作用。