姜黄素激活自噬对非酒精性脂肪性肝病大鼠线粒体途径凋亡的影响

吴鹏波，宋 琪，俞媛洁，饶 倩，张 国，柴 红，谭诗云

1.武汉大学人民医院消化内科 消化系统疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060；2.广西区人民医院消化内科

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与代谢密切相关但无过量饮酒史，以肝脏组织明显脂肪变性为特征的慢性肝脏疾病[1]。目前NAFLD发病分子机制尚不明确[2]，细胞过度凋亡及自噬水平降低被认为是其发病中间环节[3]。NAFLD目前缺乏安全特异有效的治疗药物，因此，寻求有效治疗药物成为肝病领域研究的一个热点。姜黄素是运用现代科技手段从植物姜黄块茎中提炼出来药单体。现代药理机制研究发现姜黄素具有调节自噬和细胞凋亡的作用[2, 4-5]。因此，本研究拟用姜黄素治疗高糖高脂饮食导致的NAFLD大鼠，探讨其疗效及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂线粒体内细胞色素C(mCytc)、自噬相关蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)、Caspase-9/抗体、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)及姜黄素购自Sigma公司；Bax、Bcl-2及P62购自博士德生物工程有限公司；自制高糖高脂饲料(主要成分如下：基础饲料含量82.5%，蔗糖含量5%，猪油含量10%，胆固醇含量2%，胆酸钠含量0.5%)。

1.2 实验方法实验分为正常对照组、模型组、姜黄素治疗组、自噬抑制剂组，每组大鼠10只，适应性饲养1周后进行实验。正常对照组大鼠喂养正常饲料，其他组大鼠喂养高糖高脂饲料造模，造模时间为8周；第9周开始干预，正常对照组和模型组均给予PBS灌胃作为对照，姜黄素治疗组及自噬抑制剂组给予剂量为500 mg·kg-1·d-1姜黄素灌胃；而自噬抑制剂组腹腔注射剂量为2 mg·kg-1·d-1的3-MA，药物干预时间均为8周。在第16周末早晨所有大鼠空腹静脉麻醉，腹主动脉采血，分离肝脏制作标本供油红O染色及电镜用。油红O染色观察各组大鼠肝内细胞脂滴分布，透射电镜观察肝组织中自噬相关显微结构。Western blotting检测肝组织中凋亡和自噬相关蛋白。实验过程中无大鼠死亡。

1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，组间计量资料采用单因素方差分析进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对NAFLD大鼠肝内脂肪沉积的影响各组大鼠肝脏油红O染色显示，正常对照组仅有少量的脂肪变性；模型组可见大量的肝细胞脂肪变性；与模型组相比，姜黄素治疗组及自噬抑制剂组大鼠肝内脂肪沉积明显减少；与姜黄素治疗组比，自噬抑制剂组大鼠肝内脂肪沉积明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

2.2 姜黄素对NAFLD大鼠肝脏自噬的影响如在大鼠肝组织中可见大小不一的早、中、晚期自噬泡，随机选择不同视野观察发现，正常对照组大鼠肝组织中可见较多大小不一的早、中、晚期自噬泡，模型组大鼠肝组织中自噬泡数量明显下降，而姜黄素治疗组经过姜黄素治疗后自噬泡明显增加，自噬抑制剂组自噬泡明显高于模型组，但低于姜黄素治疗组(见图2)。

图2 各组大鼠肝组织自噬体形成情况(电镜放大10 000倍) A：正常对照组；B：模型组；C：姜黄素治疗组；D：自噬抑制剂组

2.3 姜黄素对NAFLD大鼠肝组织凋亡及自噬相关蛋白表达的影响mCytc、Bax、P62、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在四组之间表达差异均有统计学意义(F=6.34,P=0.025;F=2.25,P=0.045;F=3.99,P=0.038;F=3.21,P=0.041;F=6.74,P=0.025;F=6.13,P=0.020;F=1.99,P=0.049;F=7.99,P=0.007)。与正常对照组大鼠相比，Bax、Caspase-3、Caspase-9、P62蛋白在模型组大鼠肝组织中表达均升高，而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低，经姜黄素治疗后Bax、P62、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低，而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高；自噬抑制剂组Bax、P62、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均明显低于模型组，却高于姜黄素治疗组，而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于模型组却低于姜黄素治疗组(P均<0.05)(见图3)。

图3 各组肝组织目标蛋白蛋白印迹灰度表达情况 A：正常对照组；B：模型组；C：姜黄素治疗组；D：自噬抑制剂组

3 讨论

姜黄素是从植物姜黄块茎中提炼出来药单体，被证实具有调节炎症、氧化应激和细胞凋亡等多种生物学功能[2,4]。而细胞凋亡是NAFLD发生、发展的中心环节[3-4]，因此本研究着重研究姜黄素对NAFLD大鼠模型肝细胞凋亡的影响。初步研究发现，姜黄素可明显改善大鼠模型肝组织脂肪变性，其结果与既往研究相似[2,4]。

细胞凋亡是指机体细胞为了维持内环境相对稳定，在内源性或外源性信号刺激下由多种信号传导通路和基因调控的生理性死亡。凋亡是NAFLD发生、发展过程中的关键[3-5]。线粒体、死亡受体和内质网三条途径均可参与介导细胞凋亡的发生，其中NAFLD发展过程中线粒体途径凋亡起关键作用。众所周知，众多因子参与线粒体途径凋亡的调控，近年来掀起Bcl-2家族在其中的研究热潮。Bcl-2主要家族成员Bcl-2和Bax可以直接或间接发挥凋亡调控作用[6-8]。具体表现如下：Bcl-2可有效防止mCytc向细胞质外流防止凋亡启动[9]；此外，Bcl-2还可直接与线粒体、凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)、Caspase-9相结合形成四聚体复合物抑制Caspase-9前体活化，最终进而阻断细胞凋亡。而Bax则直接诱导线粒体膜上孔道形成促使细胞色素C外流启动凋亡[9]。Caspases是各种细胞凋亡发生过程的关键介导者和执行者[10]。Caspases通过逐步发生级联反应介导细胞凋亡发生,其中 Caspase-9激活是线粒体途径诱导凋亡必需执行者[9]。而Caspase-3是多种凋亡方式关键的最终执行分子，是细胞凋亡的重要标记[8-9]。本实验研究发现，与正常对照组相比，模型组Bax、Caspase-3、Caspase-9等蛋白的表达明显升高，而mCytc、Bcl-2明显降低，经过姜黄素治疗后Bax、Caspase-3、Caspase-9等蛋白的表达明显降低，而mCytc、Bcl-2明显升高。研究结果提示，线粒体途径凋亡在NAFLD中发挥重要作用，姜黄素可通过作用线粒体发挥抑制凋亡的作用，与文献报道一致[5]。

在探索姜黄素对NAFLD保护作用的同时，一种新的细胞保护机制—细胞自噬被广泛研究。自噬是细胞承受外界环境的有害应激下产生的适应性反应，既往研究提示自噬与NAFLD的发病密切相关[2-4]。本文通过电镜及Western blotting检测发现，模型组大鼠肝组织自噬水平明显下降，姜黄素治疗组大鼠肝组织自噬水平显著上升。为了进一步探讨姜黄素是否通过激活自噬调节NAFLD大鼠肝脏细胞凋亡，实验中加入了自噬抑制剂。研究结果表明，自噬抑制剂削弱了姜黄素对细胞凋亡的抑制作用。既往研究[2]也发现在NAFLD中自噬对凋亡有着重要的影响。

本研究通过高糖高脂饮食诱导大鼠NAFLD，结果显示姜黄素明显改善NAFLD模型大鼠肝脏脂肪变性。进一步研究发现，姜黄素可通过激活自噬抑制线粒体途径凋亡改善NAFLD大鼠模型脂肪变性，然而其确切机制需要进一步研究。