淫羊藿苷联合白藜芦醇促进诱导性多能干细胞向心肌细胞分化的作用及机制研究

宣守松，罗志荣，李涵，赵恬田，牟芳芳，邵水金，国海东

淫羊藿苷联合白藜芦醇促进诱导性多能干细胞向心肌细胞分化的作用及机制研究

宣守松，罗志荣，李涵，赵恬田，牟芳芳，邵水金，国海东

上海中医药大学基础医学院解剖教研室，上海 201203

研究淫羊藿苷和白藜芦醇联合应用是否可进一步提高诱导性多能干细胞（iPS）向心肌细胞分化的作用，探讨其可能的机制。CCK8法检测淫羊藿苷和白藜芦醇对iPS增殖的影响；分别加入不同浓度淫羊藿苷和白藜芦醇诱导iPS向心肌细胞分化，RT-qPCR检测TNNI3、Cx43、α-actinin心肌细胞标志物和Oct4干细胞标志物；在常规诱导基础上，加入0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜芦醇联合诱导iPS，Western blot检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达，RT-qPCR检测miR-1和miR-133的表达。0.05 μmol/L淫羊藿苷对iPS增殖无明显影响，0.1、1、10 μmol/L淫羊藿苷均能促进iPS增殖，各浓度白藜芦醇均可抑制iPS增殖；不同浓度淫羊藿苷均可下调Oct4的表达，上调TNNI3、α-actinin和Cx43的表达；白藜芦醇可下调Oct4的表达，上调TNNI3、α-actinin和Cx43的表达。与常规诱导方法比较，添加淫羊藿苷和白藜芦醇联合处理可明显上调α-actinin mRNA、cTnT蛋白和miR-1的表达，显著下调miR-133的表达。淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导可进一步促进iPS向心肌细胞的分化，其机制可能与调控miR-1和miR-133的表达有关。

淫羊藿苷；白藜芦醇；诱导性多能干细胞；分化；miRNA

近年来，应用干细胞替代传统手段治疗心肌梗死逐渐受到重视。干细胞是具有多向分化潜能的原始细胞，在一定条件下可分化为多种功能细胞或组织器官。动物实验和初期临床试验已证实干细胞移植是一种安全可行的治疗方法，干细胞在一定程度上可修复坏死心肌，减少梗死面积，改善受损心脏功能[1-4]。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）是利用病毒载体将4个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程为类似胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）的一种干细胞类型。iPS具有与ESC类似的自我更新和多向分化潜能。因其取材容易、避免伦理问题、同体移植免疫排斥反应弱等诸多优点逐渐成为心脏再生治疗中备受关注的细胞来源。iPS在体外可被诱导为心肌细胞，移植iPS来源的心肌细胞（iPS derived cardiomyocytes，iPS-CMs）可改善心肌梗死后心功能，缩小梗死面积[5-6]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，不仅对心肌缺血具有保护作用[7]，还可促进ESC向心肌细胞分化[8-9]。近年研究发现，淫羊藿苷能提高成纤维细胞重编程为心肌样细胞的效率[10]。白藜芦醇作为一种天然的多酚物质，可抑制心肌细胞凋亡并改善心肌梗死后心功能[11]。此外，白藜芦醇还能促进干细胞向心肌细胞的分化[12]。因此，本研究主要观察淫羊藿苷和白藜芦醇联合应用是否可进一步提高iPS向心肌分化的作用，探讨其可能的机制，为解决iPS-CMs移植面临的关键问题提供依据。

1 实验材料

1.1 药物

淫羊藿苷和白藜芦醇，批号17061221，购自上海同田生物技术公司，纯度≥98%。

1.2 细胞

人iPS，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3 主要试剂与仪器

iPS培养基（货号CA1014500）、iPS消化液（货号CA3001500）和人心肌细胞分化培养基（货号CA2004500），北京赛贝生物技术有限公司；心肌肌钙蛋白T（cTnT，货号ab8295），美国Abcam公司；qPCR Master Mix（货号M3003S），美国NEB公司；miRcute miRNA提取分离试剂盒（货号DP501）和miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（货号FP411），天根生化科技（北京）有限公司；彩色预染蛋白质分子量标准（货号P0068）、CCK8（货号C0038）和BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号P0012），上海碧云天生物技术有限公司；Trizol Reagent（货号15596018），美国Invitrogen公司；ECL化学发光底物试剂盒（货号32106），美国Pierce公司。化学发光成像分析系统（Tanon 520，上海天能），多功能酶标仪（Synergy 2，BioTeck公司），电泳仪（Mini Gel Tank，美国Life Technologies公司），转膜仪（小型转印槽1703930，美国Bio-Rad公司），细胞培养箱（371，美国Thermo fisher Scientific），实时荧光定量PCR仪（StepOne，美国ABI公司）。

2 实验方法

2.1 CCK8法检测

将生长状态良好的人iPS按1∶6比例传代至96孔板，每孔加100 μL细胞悬浮液，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。于10 mg淫羊藿苷和10 mg白藜芦醇粉末中加1 mL DMSO溶解，再加9 mL PBS稀释，分别得到浓度为1×10-3mol/L和3×10-3mol/L的母液。然后用培养液将淫羊藿苷母液稀释为0.05、0.1、1、10 μmol/L，将白藜芦醇母液稀释为10、25、50、100 μmol/L。将不同浓度含淫羊藿苷和白藜芦醇的培养液加到对应标记的细胞中，每孔100 μL。分别于培养24、48、72 h后，每孔加10 μL CCK8溶液处理2 h，酶标仪检测细胞活性，读取450 nm波长处OD值。

2.2 淫羊藿苷和白藜芦醇诱导分化实验

将生长状态良好的人iPS按1∶6比例传代至12孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞密度达90%～98%时，开始诱导分化。同前配制不同浓度淫羊藿苷（0.01、0.05、0.1、1、10 μmol/L）和白藜芦醇（0.01、0.1、1 μmol/L）溶液。将不同浓度淫羊藿苷和白藜芦醇溶液加至相应孔中，每孔1 mL，连续诱导7 d，每日换液。正常组常规培养，不加诱导剂。

2.3 RT-qPCR检测

Trizol法提取细胞总RNA，经酶标仪测定RNA浓度。取1 μg总RNA反转录后获得cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix进行PCR检测。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40个循环。以GAPDH为内参对各基因表达校正并进行比较。引物序列由上海生工合成，见表1。

表1 PCR各基因引物序列

基因名称引物序列（5’～3’）产物长度/bp TNNI3 上游：TGTGGACAAGGTGGATGAAG下游：TGCCTCGAAGGTCAAAGAT103 CX43上游：CAAAATCGAATGGGGCAGGC下游：GCTGGTCCACAATGGCTAGT135 α-actinin上游：CCTGGGTATGATCTGGACCATC下游：TCCAAGGCCATCTTTCCAGC165 Oct4上游：TCTGAGACATGATGCTCTTCCTT下游：TCACTCAAGTATCACCCCCAG102 GAPDH上游：GTCAAGGCTGAGAACGGGAA下游：AAATGAGCCCCAGCCTCCTC162

2.4 白藜芦醇和淫羊藿苷联合常规诱导分化实验

选择0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜芦醇用于后续的分化实验。将生长状态良好的细胞传代至培养皿，置于培养箱中培养。实验分为正常组、淫羊藿苷组、白藜芦醇组、淫白联合组、常规诱导组、淫白联合＋常规诱导组。正常组：只加正常培养液培养，不进行诱导。淫羊藿苷组：当细胞密度达90%～98%时，更换成0.05 μmol/L淫羊藿苷溶液进行诱导，每日换液，连续7 d。白藜芦醇组：当细胞密度达90%～98%时，更换成0.1 μmol/L白藜芦醇溶液进行诱导，每日换液，连续7 d。淫白联合组：当细胞密度达90%～98%时，更换成含0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜芦醇的溶液进行诱导，每日换液，连续7 d。常规诱导组：当细胞密度达90%～98%时，使用人iPS分化培养基进行诱导分化。步骤：PBS洗2遍，每孔加2 mL诱导分化试剂Ⅰ，48 h后吸掉诱导分化试剂Ⅰ，PBS轻洗2遍；每孔加2 mL诱导分化试剂Ⅱ，48 h后吸掉诱导分化试剂Ⅱ，PBS轻洗2遍；每孔加2 mL诱导分化试剂Ⅲ，48 h后换新鲜的诱导分化试剂Ⅲ，之后液体变黄便更换新鲜诱导分化试剂Ⅲ，直至出现细胞跳动。淫白联合＋常规诱导组：当细胞密度达90%～98%时，在常规诱导的基础上，添加0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜芦醇溶液进行联合诱导分化，连续7 d。

2.5 Western blot检测

诱导7 d，用刮刀将细胞刮下，转至15 mL离心管，1000 r/min离心5 min，吸掉上清液，加入500 μL含磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液RIPA，反复吹打，冰上静置10 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，98 ℃变性5 min，电泳后将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗，4 ℃摇床孵育过夜，0.01 mol/L PBST洗3次，加入对应的二抗，室温孵育1 h。0.01 mol/L PBST洗3遍，ECL化学发光，对蛋白条带拍照并对条带灰度值进行统计分析。

2.6 miRNA表达检测

经miRcute miRNA提取分离试剂盒提取各样本miRNA，通过miRNA反转录试剂盒对1 μg miRNA行反转录。将2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer冰上溶化，配制反应体系。按下述程序进行qPCR反应：95 ℃变性15 min；94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，45个循环。

3 统计学方法

4 结果

4.1 淫羊藿苷和白藜芦醇对诱导性多能干细胞增殖的影响

结果显示，0.1 μmol/L淫羊藿苷在3个时间点均可促进iPS增殖，0.05 μmol/L淫羊藿苷对iPS增殖无明显影响；1 μmol/L淫羊藿苷48、72 h可促进iPS增殖，10 μmol/L淫羊藿苷72 h有利于iPS增殖；25、50、100 μmol/L白藜芦醇24、48、72 h均可降低iPS增殖。结果见图1。

注：与正常组比较，*P＜0.05

4.2 淫羊藿苷和白藜芦醇单独诱导对诱导性多能干细胞向心肌细胞分化的影响

不同浓度淫羊藿苷和白藜芦醇处理7 d，光镜观察和RT-qPCR检测人iPS向心肌细胞的分化。镜下可见，随着淫羊藿苷和白藜芦醇处理时间的增加，iPS发生明显改变，由圆形逐渐变为长梭形，淫羊藿苷组较白藜芦醇组形态发生改变更明显，且时间更早，见图2。RT-qPCR结果显示，不同浓度淫羊藿苷处理后均可显著下调干细胞标志物Oct4的表达，显著上调心肌标志物TNNI3、α-actinin和Cx43的表达；白藜芦醇可下调Oct4的表达，并上调TNNI3、α-actinin和Cx43的表达。见图3。

4.3 淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导对诱导性多能干细胞向心肌细胞分化的影响

根据“4.2”项下检测结果可知，0.05 μmol/L淫羊藿苷未促进iPS增殖，且能显著抑制Oct4的表达，上调TNNI3和α-actinin的表达；0.1 μmol/L白藜芦醇显著下调Oct4的表达，上调TNNI3和α-actinin的表达。因此，选择0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜芦醇对iPS联合诱导，光镜观察和RT-qPCR、Western blot检测淫羊藿苷和白藜芦醇诱导人iPS向心肌细胞分化的作用。与人iPS心肌细胞常规诱导方法比较，添加淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导后iPS-CMs更易连接成片，有利于诱导后期的搏动；淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导较淫羊藿苷和白藜芦醇单独诱导α-actinin mRNA表达升高；与常规诱导类似，淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导可显著降低Oct4的表达，且α-actinin mRNA和cTnT蛋白的表达显著升高（＜0.05）。结果见图4。

图2 淫羊藿苷和白藜芦醇诱导iPS向心肌细胞分化后形态（标尺＝100 μm）

注：与正常组比较，*P＜0.05

注：A.光镜观察（标尺=50 μm）；B、C. RT-qPCR；D、E. Western blot；与正常组比较，*P＜0.05；与淫白联合组比较，#P＜0.05；与常规诱导组比较，△P＜0.05

4.4 淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导对miR-1和miR-133表达的影响

与常规诱导组比较，添加淫羊藿苷和白藜芦醇联合处理可明显上调miR-1的表达，显著下调miR-133的表达，见图5。

注：与常规诱导组比较，△P＜0.05，△△P＜0.0

5 讨论

心肌梗死在心血管疾病中最为严重，大部分心肌梗死由冠状动脉堵塞导致。冠状动脉堵塞后，局部心肌缺血缺氧，导致心肌细胞坏死，坏死的心肌组织胶原沉积，形成纤维化瘢痕，导致心肌收缩能力下降，甚至引起心力衰竭和死亡。虽然干细胞移植治疗心肌梗死越来越受到重视，但也存在一些问题。如干细胞向心肌细胞分化和增殖问题，移植后干细胞在体内存活，以及干细胞迁移和归巢问题。干细胞治疗可直接移植未分化的干细胞，也可在体外先将干细胞诱导分化为心肌细胞，再移植到体内。在体外诱导干细胞分化为心肌细胞，得到的心肌细胞其成熟度不高，移植后与宿主心肌细胞不能形成电偶联，可能导致宿主心律不齐、心律失常[13]。

iPS-CM成熟至关重要，它是衡量一个细胞具有生理功能的基础，也是决定干细胞移植治疗成功与否的关键因素之一。有研究发现，电刺激可提高iPS向心肌分化的效率并促进心肌细胞成熟。电刺激预处理心肌细胞成为临床应用于心肌梗死治疗的有前景的方法[14]。现代药理研究表明，淫羊藿苷通过Wnt信号通路调控骨髓间充质干细胞双向分化（促进向成骨细胞分化，抑制向脂肪细胞分化）而发挥抗骨质疏松的作用[15]；并可通过介导激酶信号传递途径促进神经干细胞的自我更新与分化[16]。淫羊藿苷可诱导小鼠ESC分化为搏动功能性心肌细胞[9]。淫羊藿苷能部分通过调节JP2促进心肌分化，并改善心肌细胞的Ca2+调节功能[8]。白藜芦醇可抑制经典Wnt信号通路，激活SRF-miR-1轴，促进人iPS向心肌细胞分化[17]。TNNI3和α-actinin作为心肌细胞的特异标志物，是检测干细胞向心肌分化的重要指标[18-19]。此外，Cx43参与偶联心肌细胞间的电、化学信号的传递，也可作为心肌发育晚期的标志物[20]。本研究发现，淫羊藿苷和白藜芦醇均可上调TNNI3、Cx43、α-actinin的表达，并且淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导比淫羊藿苷和白藜芦醇单独诱导进一步上调α-actinin的表达。此外，与常规诱导比较，添加淫羊藿苷和白藜芦醇联合处理可显著上调α-actinin mRNA和cTnT蛋白的表达。

miR-1在心脏疾病中扮演着重要角色[21]。有研究表明，miR-1通过下调Dll-1-Hes-1/Notch信号调控间充质干细胞向心肌样细胞分化[22]。与miR-1相反，miR-133可通过靶向抑制SRF的表达促进成肌细胞的增殖并抑制其分化[23]。我们通过RT-qPCR检测miR-1和miR-133的表达，结果发现，添加淫羊藿苷和白藜芦醇联合处理可明显上调miR-1的表达，显著下调miR-133的表达。这可能是淫羊藿苷和白藜芦醇联合处理促进iPS-CMs成熟的作用机制之一。

此外，iPS在体外诱导分化的程度可影响iPS移植治疗心肌梗死的效果。有研究比较诱导4、8、20、30 d后iPS-CMs移植的效果，发现诱导20 d后iPS-CMs在宿主小鼠心脏中具有最高的植入率、增殖力和治疗潜力[24]。本研究将淫羊藿苷和白藜芦醇联合处理诱导时间为7 d，淫羊藿苷和白藜芦醇联合处理时间延长是否会有更好的效果值得进一步探讨。

综上所述，淫羊藿苷和白藜芦醇联合诱导可进一步促进iPS向心肌细胞的分化，其机制可能与上调miR-1和下调miR-133的表达有关。本研究为解决iPS-CMs移植治疗心肌梗死等缺血性心脏病面临的关键问题提供了新的策略和手段。

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Study on Effects and Mechanism of Icariin Combined with Resveratrol forDifferentiation of Induced Pluripotent Stem Cells into Cardiomyocytes

XUAN Shousong, LUO Zhirong, LI Han, ZHAO Tiantian, MOU Fangfang, SHAO Shuijin, GUO Haidong

To study whether the combination of icariin and resveratrol can further improve the effects of differentiation of induced pluripotent stem cells (iPS) into cardiomyocytes; To discuss its possible mechanism.CCK8 assay was used to detect the effects of icariin and resveratrol on the proliferation of iPS. Different concentrations of icariin and resveratrol were chosen to induce the differentiation of iPS into cardiomyocytes, and RT-qPCR was used to detect the changes of cardiomyocyte markers TNNI3, Cx43, α-actinin and stem cell marker Oct4. On the basis of conventional induction, the combination of 0.05 μmol/L icariin and 0.1 μmol/L resveratrol were added to induce iPS; the expression of cTnT was detected by western blot; the expression of miR-1 and miR-133 were detected by RT-qPCR.0.05 μmol/L icariin had no significant effect on the proliferation of iPS. 0.1 μmol/L, 1 μmol/L and 10 μmol/L icariin could promote the proliferation of iPS, while resveratrol could inhibit the proliferation of iPS. Different concentrations of icariin could down-regulate the expression of Oct4, but up-regulate the expressions of TNNI3, Cx43 and α-actinin; resveratrol also could decrease the expression of Oct4 and increase the expressions of TNNI3, Cx43 and α-actinin. Compared with the conventional induction method, the combination of icariin and resveratrol could significantly increase the expressions of α-actinin mRNA, cTnT protein and miR-1, but significantly inhibit the expression of miR-133.The combination of icariin and resveratrol can further promote the differentiation of iPS into cardiomyocytes, and the mechanism may be related to the regulation of expressions of miR-1 and miR-133.

icariin; resveratrol; induced pluripotent stem cells; differentiation; miRNA

R285.5

A

1005-5304(2020)08-0057-06

10.3969/j.issn.1005-5304.202004037

国家自然科学基金（81673729、81704157）；上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划（ZY (2018-2020)-CCCX-2001-01）

国海东，E-mail：hdguo@shutcm.edu.cn

（2020-04-01）

（2020-04-22；编辑：华强）