外向钾通道在纳米SiO2致肺泡巨噬细胞损伤中的作用

赵 婧

山西医科大学汾阳学院统计教研室，山西省汾阳市 032200

一项首次在全球范围内系统评估颗粒物空气污染对居民健康的报告指出，环境颗粒物(Particulate matters,PM)的短期暴露与每日呼吸系统死亡率之间存在独立相关性[1]。纳米颗粒(Nano-sized particles,NSPs)在PM尤其 PM2.5中数量比重最大。随着纳米SiO2应用的不断发展，预计未来对其安全、健康和风险评估研究的需求会更大[2-3]。目前关于纳米颗粒物毒性效应的研究较多，炎症似乎是颗粒物所致健康效应一个共同的病理生理过程[4-6]，但炎性反应机制依然不清楚。研究发现，经粉尘或脂多糖激活的巨噬细胞，通过阻断剂阻断其K+通道可以减少其TNF-α和IL-6的释放[7-8]，说明K+通道可能与炎性介质的释放相关，可能是炎性反应的关键信号。在纳米SiO2致肺损伤过程中，K+通道是否也有相似的作用？本研究通过加入K+通道阻断剂，研究电压依赖性外向钾通道(voltage-dependent Potassium channel，Kv)在纳米SiO2致NR8383细胞损伤中的调控作用，加深对纳米颗粒致肺损伤机制的认识。

1 材料与方法

1.1 材料 NR8383细胞株购自上海研究所细胞中心；纳米SiO2[粒径(15±5)nm，纯度>99%]购自杭州万景新材料公司；K+通道阻断剂：氯化四乙胺(TEA)和4-氨基吡啶(4-AP)均购自Sigma公司；Ham’sF-12购自美国sigma aldrich；胎牛血清购自美国Hyclone；细胞计数(Cell Counting Kit-8，CCK-8)试剂盒购自日本Dojindo；LDH试剂盒购自南京建成，TNF-α Elisa 试剂盒和IL-6 Elisa试剂盒均购自北京达科为。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米SiO2悬液和K+通道阻断剂的配制：用三蒸水配制2mg/ml纳米SiO2母液，高压灭菌，4℃保存备用，使用前紫外照射30min，超声15min，然后用培养液稀释纳米SiO2母液。无菌条件下，用三蒸水配制200mmol/L的TEA母液和50mmol/L的4-AP母液，使用前用培养液稀释TEA和4-AP母液。

1.2.2 细胞培养及分组：细胞在含有2mmol/L谷氨酰胺和20%胎牛血清的Ham’sF-12培养基中，在37℃含5% CO2的培养箱中培养，培养基每周更换2次，细胞每周传代1次。将对数生长期细胞稀释至5×105个/ml，然后接种于9孔培养板或24孔培养板，放入37℃、5%CO2培养箱中，培养过夜。24h后按以下分组处理细胞：阴性对照组(添加培养液，没有添加纳米SiO2或阻断剂)、阳性对照组(添加20μg/ml的纳米SiO2)、纳米SiO2组(添加5、10、20μg/ml纳米SiO2)、阻断剂组(添加20μg/ml纳米SiO2+2.5、5.0、10.0、20.0mmol/L的TEA或添加20μg/ml纳米SiO2+0.625、1.25、2.5、5mmol/L的4-AP)。

1.2.3 CCK-8试剂盒/Elisa试剂盒检测：按上述分组方法处理24h后，取出96孔培养板，按照CCK-8试剂盒说明书测定细胞存活率；取出24孔培养板，离心5min(1 000r/min)，收集培养液上清，按照Elisa试剂盒说明书测定LDH活力、TNF-α和IL-6的释放量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析(Dunnett-t检验)进行多重比较。P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米SiO2致细胞毒性效应 如表1所示，细胞存活率、LDH活力、TNF-α和IL-6的释放量呈浓度依赖性变化(P<0.05)。与阴性对照组相比，10μg/ml和20μg/ml纳米SiO2组细胞存活率降低(P<0.05)，LDH活性、TNF-α释放量升高(P<0.05)，而所有纳米SiO2组IL-6的释放量均升高(P<0.05)。

表1 纳米SiO2 致细胞毒性效应

2.2 TEA、4-AP对纳米SiO2致细胞毒性效应的影响 如表2所示，与阳性对照组相比，阻断剂组(TEA或4-AP)细胞存活率升高(P<0.05)，但高浓度阻断剂组细胞存活率降低(P<0.05)；与阳性对照组相比，阻断剂组LDH活力降低(P<0.05)，但高浓度阻断剂组LDH活力升高(P<0.05)；与阳性对照组相比，当TEA浓度≥10mmol/L，TNF-α释放量降低(P<0.05)，而所有4-AP组TNF-α释放量均降低(P<0.05)；与阳性对照组相比，两种阻断剂所有浓度组IL-6释放量均降低(P<0.05)。

表2 TEA、4-AP对纳米SiO2 所致细胞毒性效应的影响

2.3 TEA、4-AP对纳米SiO2致细胞毒性效应的标化比较 如表3所示，TEA和4-AP组细胞存活率最大标化比值分别是：121.7%、136.4%，TEA和4-AP组LDH活力最小标化比值分别是55.8%、21.6%，TEA和4-AP组TNF-α释放量最小标化比值分别是46.1%、5.9%，TEA、4-AP组IL-6释放量最小标化比值分别是5.5%、1.9%。

表3 TEA、4-AP对毒性效应指标影响的标化比较

3 讨论

本研究利用两种K+通道阻断剂TEA、4-AP研究Kv通道在纳米SiO2颗粒致NR8383细胞损伤中的作用，之所以选择TEA和4-AP这两种阻断剂，是因为4-AP对Kv通道具有特异阻断作用，TEA虽然对不同亚型K+通道都有阻断作用，但是对外向K+通道作用仅限于胞内抑制[9]。本次研究表明，纳米SiO2导致细胞存活率降低，LDH活力和炎性介质升高，与孙悦等人[10]的结论一致。但是阻断剂的加入使得纳米SiO2颗粒所致上述毒性效应均有所减弱，且4-AP的抑制作用更大。

加入两种阻断剂后，细胞存活率上升，但高剂量组细胞存活率又降低，说明阻断剂浓度过高对细胞的保护作用降低甚至产生毒副作用，为下一步实验设置最佳阻断剂浓度提供依据。LDH是一种稳定的胞质酶，存在于所有细胞中,当细胞膜受损时，LDH被迅速释放到细胞培养上清液中，这是细胞凋亡、坏死和其他形式细胞损伤的一个关键特征，因此测量受损细胞释放的LDH活力是测定细胞毒性的一种常用方法[11]。研究结果表明，阻断剂的加入使得LDH活力先降低后升高，说明阻断K+通道可以减弱纳米SiO2对细胞的膜损伤，但是浓度过高时，反而会破坏细胞膜。TNF-α是在早期炎症反应过程中出现的炎性介质，能刺激靶细胞合成和分泌其他炎性介质；IL-6能促进T、B细胞增殖分化，是炎性反应的促发剂，加剧炎症介质的产生，因此TNF-α和IL-6是评价细胞早期炎性反应的敏感指标[12]。阻断剂阻断K+通道后，由纳米SiO2诱导的TNF-α和IL-6释放量降低，说明K+通道可以减弱炎症反应。标化结果显示，TEA对各项指标有较小但是明显的影响，考虑其原因可能是TEA通过阻断其他类型的K+离子通道发挥作用，而4-AP对各项指标的影响更大，表明Kv通道在纳米SiO2致细胞损伤过程中的保护作用更大，提示Kv通道与细胞生理功能的联系更紧密一些。

颗粒物进入肺部以后引发长期持续的炎性反应是导致肺纤维化或肺癌的主要原因[13]，炎性反应由炎性体所介导，然而目前关于炎性体激活的具体途径依然存在争议，但可以确定的是肺泡巨噬细胞炎性体识别入侵的颗粒物并启动相应的炎性反应，且细胞K+外流是炎性体激活的一个前提因素[14]。本研究结果表明，Kv通道可以调控巨噬细胞产生细胞因子，但是Kv通道如何具体调节细胞分泌细胞因子，是否经激活炎性体或其某个组分，哪一种亚型K+通道起主要作用，仍然不清楚，还需要进一步研究。