浅谈固相合成类多肽原料药的工艺控制

王华

【摘要】固相化学合成法是合成类多肽原料药的重要手段之一，目前主要采用Fmoc方法进行合成。在工艺研究过程中，氨基酸缩合、树脂肽裂解、转型、反相制备纯化和冷冻干燥等步骤，对原料药质量均有不同程度的影响。本文论述了在制备工艺的不同步骤，对原料药质量的影响因素以及相应的控制策略，从而达到工艺稳定可控，生产出优质原料药。

【关键词】固相合成法;多肽;原料药;工艺控制;

【中图分类号】TQ464.7 【文献标识码】A 【文章编号】2096-7225（2020）04-0013-01

1引言

随着现代科技的不断进步，医药研发领域取得了很大程度的突破。多肽类药物作为医药的一个细分领域，生物活性广泛。尽管多肽药物问世时间较短，但是发展速度很快，近年来越来越多的多肽类新药获批上市。固相合成具有合成效率高和纯度高的优势，更容易实现自动化和工业化，在医药行业中被广泛应用。

2固相合成原理

多肽固相合成法由Merrifield 开创，被授予了诺贝尔化学奖。固相合成法是选用合适的固相载体，将氨基酸逐个连接到载体上，最后将合成的多肽链从载体上释放出来的一种新型合成方法。合成过程通常是从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固体相载体结合，然后这一氨基酸的氨基与第二个氨基酸羧基反应，重复 （缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一氨基酸缩合）步骤，连接成为长肽链^[1]。最后将肽链从树脂中分离出来，再经过制备纯化等工艺，即获得所需目标产物。

3工艺控制

固相合成法克服了液相合成法中，每一步产物都需后处理的困难。在中间体监控方面相对较弱。需要研发人员对生产工艺的深入研究，降低粗肽中杂质含量。以下从氨基酸缩合、树脂肽裂解、转型、制备纯化和冷冻干燥步骤进行阐述。

3.1氨基酸缩合

在氨基酸缩合过程中，监控缩合反应为茚三酮显色法，此法灵敏度较高。此步骤容易产生消旋转化的异构体杂质，缩合及脱Fmoc不完全形成的缺失肽杂质，以及反应试剂活性过高或反应条件剧烈形式的插入肽杂质。

常见易消旋化氨基酸有Cys、His和Phe，通常在缩合试剂中加入HOBT抑制其消旋，也可以降低反应温度、使用高效缩合试剂、提高物料比等措施，进一步降低其消旋程度，控制异构体杂质。

缺失肽类杂质引入有三个途径：①缩合反应不完全：可以通过提高物料比、高效缩合试剂和提高温度等方式进行控制;同时需关注茚三酮显色的假阳性现象。②脱Fmoc反应不完全：可以通过多次反应或提高哌啶浓度等方式进行控制。③困难位点：肽序列中含有Val，Ile，Tyr，Phe，Trp，Leu，Gln和Thr等氨基酸，相互比邻或重复时，肽链舒展性不好，合成效率下降^[2]。可以改变溶剂体系和降低树脂取代率来改善其缩合效果。

插入肽类杂质在易缩合位点更容易产生，可以通过降低反应条件，如反应温度，碱性试剂用量（DIC，DIEA等），避免缩合反应过程中Fmoc脱落后继续反应产生插入肽。

3.2树脂肽裂解

按照肽序列进行氨基酸缩合后得到树脂肽，需要将其与载体树脂分割得到目标肽。一般采用TFA切割，切割过程中加入乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三异丙基硅烷，苯酚等。主要作为碳正离子俘获试剂，俘获切割反应过程中生成的碳正离子，减少其对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应。

此步骤容易产生氨基酸侧链保护基脱落不完全（如Pbf、tBu等）、肽键断裂、非天然氨基酸修饰侧链的断裂，含-SH肽的氧化/聚合等杂质，此步骤产生的杂质较多，也比较复杂。通常从裂解配方、反应浓度、裂解温度、裂解时间等方面进行研究和控制，降低其后续制备纯化步骤中难以清除的杂质。

3.3 转型

多肽原料药大多为醋酸盐形式，树脂肽采用含三氟乙酸配方进行裂解，所得粗肽中一般含约15%的三氟乙酸，需要對其进行转盐处理。目前主要方法有反相C18填料转型、离子交换树脂和化学方法除酸等，其中C18填料转型的除去效果最好，但此方法操作繁琐，成本较高。离子交换树脂和化学方法可除去粗肽中大部分三氟乙酸，含量降低至1%左右。同时后续制备纯化步骤也具有一定的除酸效果，从而进行控制。结合工艺简繁程度和成本，目前这两种方法更受研究者的青睐。

3.4 制备纯化

在多肽原料药工艺中，制备纯化步骤是工艺中除杂最为关键的步骤。工艺中产生的相关杂质，均在此步骤中进行有效去除，从而达到原料药纯度要求。多肽序列的性质决定了纯化条件，一般根据酸碱性选择填料类型，根据溶解性选择流动相组成，根据极性大小选择梯度条件，同时也相互影响。

在纯化主要条件确定后，进一步考察上样量、溶样体系、流动相PH、制备柱清洗等影响因素，结合纯度和收率等指标，确定纯化工艺。此步骤一般不会引入新杂质，仍需关注纯化液在浓缩和贮存条件下的稳定性情况，避免在后处理过程中杂质含量增加。

3.5冷冻干燥

多肽类原料药大多采用冷冻干燥方式获得成品，冻干步骤一般在有关物质方面较为稳定，主要与原料药的一些化检指标（如醋酸含量、水分、溶液澄清度等）相关。冻干的影响因素有批量差异、冻干液体积、样品浓度、冻干液面高度和冻干液溶剂组成，以及冻干程序和设备稳定性^[3]。工艺开发前期确定其关键影响因素，在中试放大阶段进一步考察确定，从而达到稳定可控的生产工艺。

综上所述，由于多肽药物对某些疾病具有独特的治疗效果，在过去几十年里，多肽的应用在生物化学家和医务人员手中得到了越来越多的关注。多肽合成的出现和发展，促进着医药领域的进步。多肽固相合成目前主要用于中短肽链的合成，从氨基酸缩合至冷冻干燥的工艺步骤中，每个步骤均有诸多的影响因素，需要进行深入全面的工艺研究，从而开发出稳定可控，优质的原料药。对于固相合成中氨基酸缩合反应监测的弱点，需寻找更合适的监测手段，促进多肽固相合成技术的发展。

参考文献：

[1]黄蓓. 多肽固相合成研究进展[J].河南化工.2018，30（1）： 28-30.

[2]韩香，王德心. 多肽合成中“困难序列”的缩合研究进展[J].药学学报.2007.42（2）：111-117.

[3]蔡继兰.药品冻干过程中各关键环节的控制及常见问题分析[J]. 药学研究.2013.32（3）.179-182.