河北省妊娠流产奶牛及腹泻犊牛牛病毒性腹泻流行病学调查

陈颖彬 , 张明勇，李 林 , 武二斌，马亚宾，常丽云 , 关一凡 , 王建永 , 秦建华 , 赵月兰

(1.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001 ； 2.怀来县畜牧水产局，河北 怀来 075400 ； 3.张家口市畜牧技术推广站，河北 张家口 075000 ； 4.河北省畜牧良种工作站，河北 石家庄 050061)

牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的一种极为复杂、呈多种临床类型的疾病[1-2]。其特征是消化道黏膜糜烂、坏死、胃肠炎和腹泻。该病呈世界性分布，且在国内某些地区存在BVDV严重感染[3-5]。各年龄的牛均易感，但犊牛更易感，可引起腹泻、急性死亡，妊娠母畜感染可引起流产、免疫耐受、持续性感染和免疫抑制。BVDV不仅感染牛，也能感染绵羊、山羊、猪、鹿和其他反刍动物[6-8]，已成为当前严重危害我国养殖业的传染病之一。为了解河北省及周边地区奶牛群中该病感染情况，对其部分奶牛场进行了本病的感染情况调查，为更好控制BVDV感染和本病的流行提供参考。

1 材料

1.1 样品 从河北省保定市、石家庄市、廊坊市、衡水市、张家口市、沧州市、天津北辰和北京大兴8个地区奶牛场，采集有流产症状的妊娠牛血清，共计164份，进行BVDV抗体检测，采集腹泻犊牛粪样，共计79份，进行BVDV抗原检测。

1.2 主要试剂 牛病毒性腹泻-黏膜病 ELISA 抗体检测试剂盒，购自上海笃马生物技术有限公司；病毒DNA提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；DL-2 000 DNA Marker、DL-1 500 DNA Marker、2×PCR Mix，购自TIANGEN公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit, 购自TaKaRa公司；BVDV标准毒株OregonC24V，购自中国兽医药品监察所; MDBK细胞，购自中国兽医药品监察所，于含10%犊牛血清的DMEM营养液中培养，用作BVDV阴性对照。

1.3 主要仪器 凝胶成像系统、酶标仪，购自美国Bio-Rad公司；电子分析天平，购自上海上平仪器公司；台式离心机，购自上海安亭科学仪器厂；琼脂糖水平电泳槽，购自杭州博日科技有限公司； CO2培养箱，购自上海新苗医疗器械制造有限公司；PCR仪，购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 不同地区流产妊娠奶牛血清BVDV抗体检测 共采集有流产症状的妊娠牛血清164份，用牛病毒性腹泻-黏膜病ELISA 抗体检测试剂盒进行BVDV抗体检测。每次检测设有2个阴性对照孔和2个阳性对照孔。将ELISA试剂盒放于室温内平衡20 min，若部分试剂有结晶现象则将试剂放于37 ℃温育至完全溶解即可使用，血清抗体检测步骤按照试剂盒说明书进行操作。

临界值计算：将阴性对照孔的平均值加0.15，所得的数即为临界值。

结果判定：当所测的样本OD值小于临界值时，样本判定为阴性；当所测的样本OD值大于临界值时，样本判定为阳性。

2.2 不同地区腹泻奶牛粪样BVDV抗原基因检测 采集的腹泻奶牛粪样共计79份，用PCR方法进行BVDV抗原E2基因片段的检测。

2.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 公布的 BVDV的OregonC24V毒株基因组序列(登录号AF091605)，利用 Primer 5软件设计特异性引物 p1/p2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目的片段大小为781 bp，引物序列如下：上游引物 p1：5′-CCATGGAAAACATATAACACAGTGG-3′;下游引物 p2：5′-TAAGCATATGCTCCAAACCACGT-3′。

2.2.2 病毒基因组RNA的提取 取被检粪样1 g，加生理盐水4 mL，反复冻融2次，8 000 r/min离心5 min，取上清，用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒基因组RNA, 具体操作步骤按说明书进行。

2.2.3 病毒基因的 RT-PCR 扩增 以提取的基因组RNA为模板，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA，按试剂盒说明书进行。

以cDNA为模板，用p1/p2引物进行BVDVE2基因片段的PCR扩增，采用20 μL反应体系，10×ExTaqBuffer 2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL，ExTaq(5 U/μL) 0.1 μL，上下游引物各 1 μL， 模板 2 μL，ddH2O 11.9 μL。PCR 反应条件为:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火 1 min， 72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。

取5 μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增出781 bp目的片段为阳性，否则为阴性。同时，设标准毒株OregonC24V作阳性对照，正常MDBK细胞作阴性对照。

3 结果

3.1 不同地区流产妊娠奶牛血清BVDV抗体检测 对8个地区奶牛场采集的164份血清进行BVDV 抗体ELISA检测，结果见表1。BVDV 抗体平均检出率为46.95%，其中，保定地区BVDV 抗体检出率最低为4.0%，其次是沧州地区，阳性检出率为20%，天津北辰地区接近平均值，廊坊和衡水地区BVDV抗体检出率最高，均为100%，北京大兴阳性率也高达80%。

3.2 不同地区腹泻犊牛粪样BVDV抗原E2基因检测 将犊牛腹泻粪样进行 BVDVE2基因PCR扩增，部分检样扩增出大小约为781 bp特异性片段，与预期目的片段大小相符(见图1)。由图1可知，5份被检样品为阳性结果，2份被检样品为阴性结果。

79份被检粪样E2基因PCR检测结果见表2，由表2可知，BVDVE2 基因阳性检出率平均为40.5%，廊坊地区E2基因阳性率最高为100%，其次是石家庄和衡水地区，阳性检出率为44.4%～50%，沧州、北京大兴和天津北辰地区则低于平均值，保定地区E2基因阳性检出率最低为10%。

表1 流产妊娠奶牛血清BVDV抗体ELISA检测结果Table 1 Results of BVDV antibody in serum samples examined by sandwich ELISA in aborted bovine

图1 部分粪样BVDV E2基因 PCR检测结果Fig.1 PCR amplification of BVDV E2 gene in the some feces samplesM1: DL-1 500 Marker; M2: DL-2 000 Marker; 1: OregonC24V 阳性对照; 2～4:被检样品; 5: MDBK阴性对照; 6～9: 被检样品M1: DL-1 500 Marker; M2: DL-2 000 Marker; 1: OregonC24V positive control; 2～4: Feces samples; 5: MDBK cell negative control; 6～9: Feces samples

4 讨论

表2 犊牛腹泻粪便样品中BVDV抗原E2基因检测结果Table 2 Results of BVDV E2 gene of fecal samples examined by PCR

牛病毒性腹泻/黏膜病是威胁牛群健康的重要传染性疾病之一， 可对牛群繁殖系统、呼吸系统、消化系统、产奶量等产生严重影响，进而影响我国畜牧业的快速发展。据统计，北京市规模化养殖场每年由于腹泻和繁殖障碍淘汰的奶牛占到总淘汰牛的30%以上，其中牛病毒性腹泻是造成牛群腹泻和繁殖障碍的一个重要因素[9]。本次对不同地区流产症状妊娠奶牛血清BVDV抗体检测结果显示，BVDV抗体平均检出率为46.95%，其中，保定地区BVDV抗体检出率最低为4.0%，其次是沧州地区，阳性检出率为20%，而廊坊和衡水地区BVDV 抗体检出率最高，均为100%，北京大兴阳性率也高达80%，石家庄和天津北辰阳性率接近平均水平。调查结果表明，不同地区流产症状妊娠奶牛群中均存在BVDV感染，这也可能是导致妊娠奶牛流产的主要原因之一。

我国不少地区的牛群不同程度的感染了BVDV，因此各地应高度重视本病。据报导，2013年内蒙古3个地区6个养殖场进行BVDV的流行病调查结果显示，其总阳性率为58.35%[10]。2015年新疆部分地区奶牛场BVDV流行病学调查结果，血清抗体阳性率在90%以上[11]。2016年山东地区规模化牛场的BVDV 调查表明，其血清抗体阳性率达65%[12]。甘肃省部分地区牛病毒性腹泻/黏膜病，阳性率为56.36%[13]。湖南省的2 个规模奶牛场从未进行过BVDV 疫苗免疫,但BVDV阳性率为92.17%,说明在湖南的规模奶牛场中BVDV感染已经存在[14]。河南15个县市牛群的BVDV抗体阳性率平均为22.9%，事实上实际的感染率可能更高, 因检测血清抗体不能检出持续性感染牛[15]。检查抗体一方面难以作出早期诊断，另一方面由于存在着许多持续性感染动物(免疫耐受)而漏检，因此也难以查出所有的传染源。目前，国外对持续性感染BVDV的牛多采用从白细胞中分离病毒的方法，但该方法实施比较困难，加之病毒分离率低及费用昂贵，因而难以用于大批奶牛的检疫。随着分子生物学检测技术被应用于牛病毒性腹泻-黏膜病的诊断，核酸扩增技术目前已成为应用较为广泛的实验室诊断方法,该方法特异性强，敏感性高。本试验采用BVDV主要结构蛋白E2基因PCR扩增技术对不同地区腹泻奶牛粪样BVDV抗原E2基因进行检测，阳性检出率平均为 40.5%，廊坊地区阳性率最高为100%，其次是石家庄和衡水地区，阳性检出率为44.4%～50%，张家口、沧州、天津北辰、北京大兴阳性检出率低于平均水平，保定地区阳性检出率最低为10%。调查结果表明，不同地区被检奶牛群不同程度的感染了BVDV。本地区奶牛BVDV感染流行可能与其持续性感染(PI)有关，其PI牛体内不产生抗体，却终生带毒、排毒。持续性感染是造成BVD-MD扩散的重要传染源，因此检出和消除PI牛是控制BVD-MD的中心环节。