基于网络药理学和分子对接技术探索黄酮类化合物治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的作用机制

曲一帆，徐凤英，王玉珍，谢基明

(1.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古 呼和浩特 010060；2.内蒙古农业大学生命科学学院制药工程系；3.内蒙古自治区人民医院检验科)

2019年12月，我国武汉地区爆发了不明原因冠状病毒肺炎，之后陆续全国各地乃至全球均有爆发此类疫情现象[1]。通过对肺炎患者分离到的病毒测序分析显示是一种新型冠状病毒。世界卫生组织正式将这次新型冠状病毒肺炎命名为“COVID-19”，国际病毒分类学委员会则将“新型冠状病毒”命名为“Severe Acute Respiratory Syndrome-Corona Virus-2”,简称“SARS-CoV-2”[2]。SARS-CoV-2主要经呼吸道和密切接触传播，具有传染能力强、人群普遍易感的特点，病毒主要通过人血管紧张素转换酶Ⅱ(ACE2)受体促进病毒进入靶细胞。COVID-19患者早期以发热、干咳、乏力为主要表现，严重者可快速发展为多器官功能衰竭，甚至死亡[3]。在我国COVID-19被确定为乙类传染病，并按照甲类传染病管理办法进行管控。现西医尚无针对COVID-19的特效药物，目前临床以对症治疗为主，治疗炎症风暴的药物多考虑皮质激素，而化学药的使用在后期会出现一系列的不良反应[4]。

黄酮类化合物(Flavonoids)是一类普遍分布在各种食源性植物及药用性植物当中，具有2-苯基色原酮母核结构的一种天然化合物。其具有强大的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、抗骨质疏松等多种生物功能，且副作用小，生物活性高，因此备受研究者们的关注[5]。基于国家中医药管理局《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中医方案部分》文件，并从现有的中草药资源总结发现，中药复方中具有治疗COVID-19的活性化合物有较多为黄酮类化合物。因此探究黄酮类化合物治疗COVID-19的分子机制具有明确的现实意义，以期为黄酮类化合物进一步研究提供有力参考[6]。

网络药理学与分子对接是一种以系统生物学和分子药理学为基础，借助计算机生物信息大数据网络，对化合物、疾病、病原体进行多靶点、多层次、多途径的系统分析，从而达到获取疾病及生理过程数据的技术[7]。由于中医药复方中的多成分与对目的疾病多靶点的特点，系统地阐明其中化合物的生物过程十分困难。选用网络药理学与分子对接分析化合物作用效果是一种十分贴切的技术手段，它能够将化合物对于病原体的作用过程可视化、系统化、信息化的展现出来，为中药新药开发提供科学指导，也为临床应用提供理论支持[8]。本研究拟通过网络药理学与分子对接手段，探寻常见的黄酮类化合物作用于COVID-19的靶点网信息，系统阐述其治疗疾病的分子机理。

1 材料与方法

1.1黄酮类化合物基本药物参数与靶点的收集 通过CNKI、PubMed查阅相关文献[9]及有关临床报道[10]，收集现有抗击COVID-19中药复方中及单体的常见黄酮类化合物及其衍生物共计18个，借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)获取其基本药理数据。口服生物利用度(OB)是指化合物在给药后，吸收进入血液系统并且机体可以吸收利用的相对量，类药性(DL)则多用于评估化合物可能成为药物的可能性，二者数字越大，越能代表该化合物对人体有研究价值，因此根据网络药理学系统特点，以OB≥30 %和DL ≥ 0.18为活性成分的筛选阈值，筛选出符合条件的活性成分。并在数据库中筛出每一个化合物作用的靶点(Relate Tagret)信息，并保存其数据详细信息。

1.2化合物-靶点的网络构建 利用1.1中获取的靶点信息，通过Uniprot数据库规范得到的靶点名称，将规范后的靶点信息导入perl计算机程序语言，得到符合Cytoscape3.7.2软件识别的网络节点文件。在Java1.8环境下，利用Cytoscape3.7.2构建黄酮类化合物-靶点网络图。

1.3疾病靶点提取及化合物-疾病共同靶点的网络构建 通过GeneCards数据库，以novel coronavirus为关键词键入搜索，下载关于COVID-19疾病的靶点信息，利用R语言程序得到化合物与疾病的共同靶点。导出共同靶点文件，使用R语言做出Venn图，使用Cytoscape3.7.2软件做出化合物-疾病靶点网络图。

1.4共同靶点的PPI网络图和频次图 PPI(protein-protein interaction)即蛋白质之间的相互联系，从编码蛋白质的基因间的相互作用可推断出蛋白质间的相互作用[11]。使用1.3中共同靶点文件，将文件内容导入至STRING数据库，选择物种为Homo sapiens，删除无作用靶点，可得到蛋白互作PPI网络图。利用R语言程序可计算得出相互作用频次，并绘制频次图展示相关靶点。

1.5GO基因富集分析 GO(Gene Ontology)富集分析可以了解目的基因群富集在哪些生物功能(Biological Process,GO-BP)、细胞定位(Cellular Component,GO-CC)、分子过程(Molecular Function,GO-MF)三个方面[12]。使用1.3中共同靶点文件，将文件内容导入至Metascape数据库，选择物种为H.sapiens，提交数据，P值定义为0.01，继续进行个性化分析并下载得到数据。

1.6KEGG信号通路富集分析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析可以将目的靶点群的通路功能富集归类，得到可视化通路数据[13]。将1.3中的共同靶点文件，在R语言程序中利用Bioconductor编程代码，运算得出KEGG数据图。

1.7化合物-疾病靶点分子对接 使用ChemBioDraw14.0和ChemBio3D14.0软件构建黄酮类化合物3D模型。从RCSB-PDB数据库中下载SARS-CoV-2最有关靶点ACE2[14](PDBID：1R42)的立体分子结构及其配体文件。运用PyMOL软件对ACE2进行去水、加氢等操作，利用Auto Dock1.5.6软件将靶点蛋白配体选定，设置去除配体后的Grid Box坐标，最后运行PyMOL软件进行对接。结合能小于0说明配体位置与化合物可以自发结合。

2 结果

2.1黄酮类化合物基本药物参数与靶点收集结果 通过查阅文献及相关临床报道，借助TCMSP数据库，以OB≥30 %和DL≥0.18为活性成分的筛选阈值，发现所选的18个黄酮类类化合物均符合设定条件，相关药物参数及靶点数见表1。

表1 黄酮类化合物基本药物参数及作用靶点个数

2.2化合物-靶点的网络绘制结果 将TCMSP数据库中查阅到的化合物相关靶点信息导出以后，通过Uniprot数据库规范得到的靶点名称，利用Cytoscape3.7.2构建黄酮类化合物-靶点网络图，如图1。结果显示共计282个节点(其中黄酮类化合物共有18个节点)，594条边。其中槲皮素、山奈酚、木犀草素、表没食子儿茶素没食子酸酯表现出较多的靶点对应能力。

2.3疾病靶点提取结果及化合物-疾病共同靶点的网络图结果分析 通过GeneCards数据库，以novel coronavirus为关键词键入搜索后，共得到相关疾病靶点350个，根据R语言运行结果，黄酮类化合物与疾病的共同靶点55个，并依次绘制Venn图，如图2。根据Cytoscape3.7.2运行结果得出共有74个节点(其中黄酮类化合物共有18个节点，疾病1个节点)，227条边，如图3。

2.4化合物-疾病共同靶点的PPI网络图及结果分析 利用STRING数据库，选择物种为Homo sapiens，删除无作用靶点，可得到PPI网络图。利用R语言程序可计算得出相互作用频次，并绘制频次图展示相关靶点。其中节点表示靶点蛋白，节点内图示为靶蛋白三维构象，蛋白与蛋白之间线条表示靶点之间相互作用关系，线条越多表示关联度越大。结果如图4显示，共有节点55个，边722条，数据并得出靶蛋白平均节点度值26.3，聚类系数0,743，P<0.001。对互做数排名前30的靶点做频次图，如图5。结果显示，IL6、MAPK8、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL4、PTGS2、IFNG等靶蛋白可能是黄酮类化合物防治COVID-19潜在的关键靶点。

2.5GO基因富集结果分析 根据Metascape数据库，选择物种为H.sapiens，提交数据后显示的结果，在P值定义为0.01，个性化分析计算下得到数据，整理得到GO三个组分的图表，如图6。纵坐标为Metascape数据库GO编码及相关GO靶点名，横坐标为-log(10)P。由上至下为前20条GO-BP、17条GO-MF以及9条GO-CC。相关性越大则颜色越深。

2.6KEGG信号通路富集结果分析 根据R语言程序中利用Bioconductor编程代码，以P<0.05为阈值，运算得出的KEGG数据图，如图7。共富集通路155条，取基因参与最多的前20条做图，横坐标代表靶点参与通路个数，其中多条与呼吸道感染或病毒感染反应有关，其中包括IL-17 signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、 Influenza A、Pertussis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Measles。依据结果绘制高级气泡图，纵坐标为信号通路，横坐标为通路靶点占总靶点比值，气泡大小代表个数，气泡颜色代表P值，以-log(10)P表示，如图8。

2.7黄酮类化合物与ACE2分子对接结果分析 通常认为受体与配体结合构象越稳定，能量越低，越容易结合产生作用[15]。在Auto Dock1.5.6中选定ACE2的配体，并将18种黄酮类化合物一一与配体对接并利用脚本计算结合能。一般情况下结合能小于0则可以自发对接，选定结合能<-5KJ/mol为阈值标准。结果显示18种黄酮类化合物与ACE2的结合能均小于0，说明黄酮类化合物与ACE2具有非常好的结合活性。小于-5KJ/mol的黄酮类化合物有13种，其中木犀草素、异鼠李素、黄芩素、橙皮素、儿茶素等与《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第七版)》推荐用药和国外一线抗病毒药[16]相比具有十分优异的结合力。结合能结果见表2，部分化合物分子对接模式见图9。

表2 黄酮类化合物与部分抗病毒药物ACE2结合能

3 讨论

COVID-19是在2019年底爆发的，以SARS-CoV-2为病原体，通过人体ACE2感染细胞、累及各种器官的一种急性呼吸道传染病。以乏力、干咳、呼吸困难及发热为主要临床表现，其流行病学特征和致病机理尚不完全明确，迄今也未有特效药物，其治疗方案也在不断更替[17]。有数据表明，中西医结合治疗COVID-19效果良好，重点疫区湖北相关医院的中医药参与救治比例超过三分之二，此次疫情配合中药复方或单体参与救治已成为成熟方案[18]。网络药理学与分子对接技术可在基于传统功效及临床定位的基础上，系统地分析中药复方或者单味中药其中的化合物作用机制，揭示中药药效价值，本研究通过对诊疗方案高频药味及其中有效的黄酮类化合物进行拆分分析，将病原体所嗜的ACE2进行对接，预测黄酮类化合物对COVID-19的治疗价值，为临床合理用药提供有力依据。

经过筛选，共有18种黄酮类化合物，作用于各类疾病靶点264个，一个化合物可对应多个靶点，同一靶点可对应不同化合物，充分体现了黄酮类化合物多成分、多靶点的特性，也充分显示出黄酮类化合物家族强大的疾病调控能力。其中可作用于COVID-19的靶点55个，从PPI网络图可以推测黄酮类化合物可通过调控720余种蛋白途径参与疾病的转归。GO功能富集分析发现，黄酮类化合物主要对细胞因子介导的信号转导、趋化因子、磷酸化和线粒体凋亡等生物学过程起调节作用。KEGG通路富集分析发现黄酮类化合物主要通过调控病毒炎症通路及呼吸道感染通路，例如IL-17 signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、 Influenza A、Pertussis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Measles、Tuberculosis。说明黄酮类化合物可以通过抑制这类通路的炎性因子活化、缓解机体的细胞因子风暴达到对抗疾病的目的。最新研究提出理论，新型冠状病毒感染人体的关键在于SARS-CoV-2表面的S蛋白与人体ACE2蛋白的结合，即病毒通过其表面S蛋白与ACE2结合从而侵入人体，破坏其与ACE2的结合，病毒则无法侵入人体[19]。经过分子对接及结合能计算得出黄酮类化合物与ACE2结合能小，分子对接效果十分优秀，其中异鼠李素、黄芩素可能作为抗SARS-CoV-2的潜在活性成分，其作用机制可能是通过影响新型冠状病毒S蛋白受体结构域与ACE2蛋白结构域复合物结构的稳定从而起到抗病毒的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学的技术，对黄酮类化合物作用于COVID-19的靶点、通路和生物功能进行系统地分析，从分子水平阐述了黄酮类化合物多靶点、多途径的作用机制。配合分子对接技术进一步论证黄酮类化合物作为防治COVID-19的潜在能力，具有一定的预测性和准确性。本研究将为后期深入研究黄酮类化合物的抗病毒与抗炎机制提供合理的指导意义，也为临床合理治疗提供新的思路及方案。