小鼠卵巢组织切片HE和Masson染色法的比较

冯梓欣，田雪梅

卵巢是雌性动物生殖系统的重要器官，卵泡是卵巢组织中的主要结构成分。卵巢长期处于动态变化中，其中卵泡受到一系列复杂精细的调控而发生形态和结构的变化，处于不同的发育阶段[1]。卵泡根据形态和功能可分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段，不具备生长优势的卵泡在发育进程中形成闭锁卵泡[2]。对卵巢的组织学和病理学研究中，常常需要借助染色来观察组织切片中卵泡的形态结构，识别各种发育阶段的卵泡。HE、PAS、Masson染色是小鼠卵巢组织石蜡切片常用的染色方法[3]。本文比较观察HE染色和Masson染色的卵巢组织切片，以探讨这两种染色方法在卵巢组织切片中的应用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1试剂 Bouin液：饱和苦味酸水溶液75 mL，10%中性福尔马林25 mL，冰醋酸5 mL；Ehrlich苏木精：取苏木精2 g加入100 mL无水乙醇，37 ℃搅拌溶解后加入甘油100 mL，另取硫酸铝钾3 g加入100 mL蒸馏水，充分混匀，将上述两种液体充分混匀后再加入10 mL冰醋酸，自然氧化成熟后过滤使用；伊红染液：伊红1 g，95%乙醇100 mL；1%盐酸乙醇溶液：70%乙醇99 mL，浓盐酸1 mL；Masson染色试剂盒购自南京建成科技公司，内含核染液(主要成分为苏木精染液)、质染液(丽春红、酸性复红混合染液)、分色液(磷钼酸水溶液)、冲洗液(乙酸水溶液)、复染液(苯胺蓝染液)。

1.1.2仪器 石蜡包埋机(徕卡YB-6LF)；切片机(徕卡RM2235)；显微镜(尼康ECLIPSE 80i)。

1.2 小鼠卵巢石蜡切片制作小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉，颈椎脱臼法处死，取出双侧卵巢投入新鲜配制的Bouin液中固定12 h。实验动物的操作均符合华南师范大学实验动物伦理学管理条例。将固定后的卵巢于70%乙醇中脱去黄色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。包埋好的组织蜡块，连续5 μm厚切片，HE染色和Masson染色分别用于相邻切片。

1.3 HE染色切片常规脱蜡至水，Ehrlich苏木精染色20 min，1%盐酸乙醇分色，自来水蓝化20 min，用蒸馏水洗；再经70%、80%和90%乙醇各3 min，伊红染液10 s；95%、100%乙醇各10 min，二甲苯透明，中性树胶封固，普通光镜下观察。

1.4 Masson染色染色按照试剂盒说明书中的方法进行操作。切片常规脱蜡至水，核染液染色1 min，冲洗液冲洗30 s；质染液染色10 s，冲洗液冲洗30 s；分化液分色8 min；弃去分色液后直接用复染液染色3 min，100%乙醇洗净浮色，二甲苯透明，中性树胶封固，普通光学显微镜观察。

2 结果

初级卵泡由一个卵母细胞和外周包围的若干层卵泡细胞组成，卵母细胞和卵泡细胞间有一层透明带(图1A)；次级卵泡体积增大，透明带增厚，卵泡细胞间出现大小不等的腔隙(图1B)。HE染色的切片中，卵巢组织中各发育阶段卵泡及卵巢基质的形态结构清晰可见，细胞核呈蓝紫色，细胞质及间质成分呈浅红色，卵泡中卵母细胞、卵泡细胞、透明带均清晰可见；Masson染色的切片中，透明带和含有胶原蛋白的结构呈清晰的蓝色，其他成分均呈橙红色，能分辨各阶段卵泡及卵巢基质，但不能清晰地显示卵泡细胞、卵泡膜细胞和卵巢基质成分(图1C、D)。

对两种染色法进行观察比较发现，HE染色的切片中表现正常的初级卵泡(图2A)和次级卵泡(图2B)，在Masson染色的切片中可观察到透明带皱缩及凹陷(图2C、D)，该初级卵泡和次级卵泡均呈现为早期闭锁状态。HE染色的切片中透明带皱缩，显示为闭锁的卵泡，在Masson染色的切片中可观察到该卵泡的卵母细胞染色较深，透明带皱缩成锯齿状，闭锁状态显示更为明显。

3 讨论

在哺乳动物卵巢中存在不同发育阶段的卵泡，大部分卵泡在发育过程中逐渐发生闭锁，只有少部分能够发育为成熟的卵泡。在一些卵巢组织病理变化的研究中常会计数闭锁卵泡和非闭锁卵泡的数量[4]。因此，需要准确的分辨闭锁卵泡和非闭锁卵泡。闭锁卵泡分为早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡。早期闭锁卵泡主要表现为透明带皱缩和少量卵泡细胞发生凋亡；晚期闭锁卵泡主要表现为卵母细胞明显固缩，卵泡细胞凋亡严重，透明带塌陷。Liu等[5]报道HE染色结合卵泡细胞凋亡检测可识别晚期闭锁卵泡，但不易识别早期闭锁卵泡。

①A①B①C①D②A②B②C②D

常规的HE染色中，细胞核被苏木精染成蓝紫色，细胞质与其他组织结构被伊红染成浅红色，透明带呈现为卵母细胞和卵泡细胞间一层均质的浅红色结构，与其周围结构的区分不是很明显。Masson染色法主要用于组织中纤维成分的染色[6]，其原理是根据染料分子量大小和组织渗透性，使不同组织成分染上鲜明的颜色，分子量大的染料如苯胺蓝可进入到结构松散、渗透性高的组织中。卵泡的透明带是由颗粒物质排列成疏松的纤维状结构，所以Masson染色中卵泡的透明带呈蓝色，与周围染成橙红色的组织成分形成对比，更能显示透明带形态的变化。因此在卵巢组织的观察中，分别进行Masson染色和HE染色，能更好地观察不同发育状态的卵泡并识别早期闭锁卵泡。