厌氧菌的临床检验分析

翟俊伟

1 实验方法和实验原理

处于无氧、少氧、氧化还原电势低的情况下，能够繁殖的细菌统称厌氧菌。厌氧菌通常分布在人体肠道、泌尿生殖、口腔中，调解正常菌群，如果人体出现菌群失调，厌氧菌将对人体多个部位进行侵犯，引发内源性厌氧菌感染。

厌氧菌的培养要保证无氧环境下操作。厌氧产气袋GENbaganaer中的成分包括活性炭、抗坏血酸钠盐和其他有机和无机成分，能够吸收02并且释放CO2。作用：有效时间为2.5小时，气袋中含02浓度<0.1%，C02气体在24小时后浓度>15%。将气袋放入已经接种好的平板，然后将气袋内空气挤出，将袋口封闭好。半小时之内，袋内处于无气环境。化学指示剂条显示白色，说明袋内符合厌氧状态。

2 具体操作方法

2.1 接种培养物

结合非选择培养基和卡那霉素一万古霉素冻溶血琼脂培养基，能够使厌氧菌检出率达到94%的标准。运用50%乙醇和标本混合作用1消失的方法，用于将芽孢梭菌分离的主要方式，成功收集标本后，尽快接种，具体接种操作为：

①接种組织块标本时，应将待检组织块移入到无菌组织研磨器中，保证操作环境处于无氧条件，或者在厌氧箱内进行操作。接种组织匀浆液标本和液体标本采用同样的操作方法。

②接种液体标本时，运用毛细吸管作为工具，滴加1滴或数滴于含维生素Kl（10μg/mL）和氯化血红素（5μg/mL）的布鲁血琼脂平板（BRBA），将三区进行明确划线，确保明确区分各个菌落。完成接种操作之后，马上把平皿放入到厌氧袋中，将厌氧产气袋打开，与化学指示剂同时放入厌氧袋，将袋内空气赶走，运用两个塑料夹子将袋口密封，孵育培养条件为35℃。

③血液标本与厌氧瓶直接接种。

④无菌体液标本与BRBA平皿、厌氧瓶直接接种。

⑤一旦怀疑存在芽孢梭菌，必须对标本进行加热处理或者乙醇处理。

⑥接种时，运用直接涂片法，对标本进行革兰染色检查。

2.2 运用直接涂片法对原始标本接种培养基后涂片检查

一般情况下，拭子上剩余标本足以用于涂片。涂片检查能够发现是否存在细菌、微生物，判断他们的种类、数量、形状、芽孢杆菌的具体位置、革兰阳性菌分枝的特点，格兰阳性球菌的排列情况、格兰阴性杆菌的形状等。

2.3 孵育培养物

孵育培养物的平板必须达到48小时以上的除此厌氧孵育时间，针对于生长慢的微生物孵育时间要延长到7天之久，如果在48消失内打开厌氧罐，然后再次重新孵育，厌氧菌株由于对氧高度敏感，所以会停止生长。

2.4 培养物的检查经适当孵育后的处理操作

培养物的检查经适当孵育后，将所有平板从厌氧袋取出，争取1次全部取出，避免平皿多次暴露在空气中，对细菌生长情况运用放大镜进行检查、甄别。将菌落类型做好详细记录，具体处理步骤如下：

2.4.1 耐氧试验的具体操作

①选择各种类型的菌落进行接种操作

纯BRBA平板置于厌氧环境下;巧克力琼脂平板，放置在C02条件下;BRBA平板，放置在需氧条件下。

②厌氧BRBA平板，C02平板需要孵育48小时，需氧以18～24小时培养孵育时间为主。与此同时，紫外线下对初代分离BRBA平板进行检查，查看是否有产黑色Porphyromonas及Prevotella的菌落，这种菌落通常表现为砖红色荧光。

③试验结果判读

经过试验发现，厌氧培养生长物的生长条件并不局限于一种，厌氧环境以及大气环境中厌氧培养生长物都可以实现快速生长，这表明被检厌氧培养生长物属于兼性厌氧菌;试验结果表明，被检厌氧培养物仅能在厌氧环境中生长，在大气环境中并未呈现正常生长状况，这种被检厌氧培养生长物属于专性厌氧菌。

④耐氧试验阴性结果

厌氧培养物经过一夜达到48小时的孵育时间之后，对代培养的需氧平板和C02平板进行分别检查，检查发现有菌生长，表明不是厌氧菌。必须经由需氧鉴定程序准确鉴定。

⑤耐氧试验阳性结果

厌氧培养物经过48小时的孵育时间之后，需氧环境以及C02平板都没有出现有菌生长情况，应对次代培养的生长情况、色素产生、溶血、琼脂凹陷、菌落形态状况做好记录。如果菌量充足，有必要运用APl20A对此菌做出生化鉴定。

2.4.2 菌种鉴定

①根据耐氧试验、细菌特点、革兰染色、菌落特点，确定厌氧群或属。

②APl20A的操作和判读依据《APl20A操作程序》。

③缺少APl鉴定条的情况下，适合对厌氧革兰阴性菌的菌种做出准确鉴定：主要是鉴定含一定量抗生素纸片的敏感性（包括卡那霉素纸片每片1mg，万古霉素纸片每片5μg，多黏菌素E纸片每片l0μg）。厌氧菌纯培养抑菌环达到10mm标准则认定为敏感。靛基质、硝酸盐纸片、触酶等试验是鉴定厌氧菌群、属和具体菌株名称的主要方式。

2.4.3 报告结果

①试验结果的初步报告有利于临床应用。厌氧菌生长速度较慢，因此需要几天的试验时间，才能得出试验结果，最终鉴定菌株的种类，所以，实验室必须在德奥初步鉴定结果时，立即向临床医生报告。

②血、脑脊液和其他无菌体液作为试验标本，采取电话报告的方式，告之革兰染色试验以及初步耐氧试验结果。

③报告格式为：“厌氧培养，经鉴定发现×××”，×××代表种名。

参考文献

陈宏飞.浅析厌氧菌培养及检验在临床诊断中的应用[J].基层医学论坛，2019，23（32）：4670-4672.

温海楠，时东彦，赵建宏，谢守军.我院临床分离厌氧菌的分布特征及药敏谱型[J].中国抗生素杂志，2018，43（05）：614-619.