肠愈宁颗粒对溃疡性结肠炎大鼠部分免疫机制的影响

王海强 王瑶 李国庆 刘朝霞 王琳晶 田延昭 栾凤 艾宗雄

摘要 目的：研究不同剂量的肠愈宁颗粒对溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠结肠血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-4（IL-4）表达的影响，阐述其抗UC的免疫机制。方法：48只雄性Wistar大鼠平均随机分成6组：空白对照组、模型组、肠愈宁高剂量组、肠愈宁中剂量组、肠愈宁低剂量组、美沙拉嗪对照组。应用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇复合灌肠法诱导UC大鼠模型，评估疾病活动指数（DAI），结肠黏膜损伤指数（CMDI）并进行组织损伤指数（TDI）评分，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠IL-1β、TNF-α、IL-4的变化。结果：注入5% TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL连续1周可成功导致大鼠患上溃疡性结肠炎（UC），肠愈宁颗粒可对抗5% TNBS 50 mg/kg+50%乙醇所致的大鼠UC，与模型组比较，加入肠愈宁高剂量组、肠愈宁中剂量组的DAI、CMDI和TDI评分均降低，IL-1β、TNF-α表达下调，IL-4表达上调。结论：肠愈宁颗粒抵抗溃疡性结肠炎（UC）的作用显著，其机制可能与下调促炎因子TNF-α以及白细胞介素IL-1β的表达，上调促炎因子IL-4的表达有关。

关键词 肠愈宁颗粒;溃疡性结肠炎;血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4

Abstract Objective：To investigate the different doses of Changyuning granules on the expression of IL-1β，TNF-α and IL-4 in mice with ulcerative colitis （UC） and observe its immune mechanism against UC. Methods：Forty-eight male wistar rats were randomly divided into six groups：control group，model group， high-dose group，medium-dose group，low-dose group of Changyuning granules， mesalazine group.The UC models were established by TNBS/ethanol composite enema， disease activity index （DAI），colon macroscopic damage index （CMDI） and tissue damage index （TDI） were assessed.Serum IL-1β，TNF-α and IL-4 were detected by ELISA. Results：Injection of 5% TNBS 50 mg/kg+50% ethanol 0.25 mL for one week could successfully lead to ulcerative colitis （UC） in rats and Changyuning granules can resist UC induced rats.Compared with the model group，the DAI，CMDI and TDI scores of the high-dose group and the middle-dose group of Changyuning granules were all reduced，the expression of IL-1β， TNF-α was down-regulated and the expression of IL-4 was up-regulated. Conclusion：Changyuning granules have significant resistance to ulcerative colitis （UC）.The mechanism may be related to reducing the expression of the TNF-α as well as IL-1β and increasing the expression of the IL-4.

Keywords Changyuning; Ulcerative colitis; IL-1β; TNF-α; IL-4

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.010

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是一种以肠道恶变和黏膜损伤为特征的胃肠道慢性病[1]。作为炎性反应性肠病（IBD）的一种主要形式[2]，往往伴有缓解期和复发期且其黏膜炎性反应仅局限于结肠[3]。临床表现包括腹部痉挛、疼痛、血痢[4]、直肠出血[5]、体质量减轻、发热和易疲劳性。目前溃疡性结肠炎（UC）肠道炎性反应性疾病在世界范围内的发病率正在增加[6]。而对于UC这方面的研究虽然已经取得了相当大的进展，但是对于UC患病具体病因尚不明确[7]，临床上，治疗UC的药物较多，虽然疗效较好，但是不良反应多，患者长期依从性较难，因此从中医药寻找新的治疗药物仍然是本病的研究热点。

本课题组具有多年使用中药复方治疗结肠炎的临床实践，并结合药效学实验发现肠愈宁方治疗大肠湿热型溃疡性结肠炎效果显著。据文献记载，疾病活动度与菌免疫系统相关递质相关，随着病情加重，患者的免疫力也逐渐下降[8-9]。Fuchs等也假设UC可能主要是由一种免疫失衡的状态而引起的[10]。因此本项目组在前期用肠愈宁方来治疗患有溃疡性结肠炎的效果较好基础上，旨在研究肠愈宁方治疗活动期溃疡行结肠炎的作用机制，深入研究中药治疗溃疡性结肠炎的作用机制，可为抗溃疡性结肠炎新药的研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性Wistar大鼠48只，实验动物使用许可证编号：SYXK（黑）-2016-0005，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。在湿度、温度适宜且通风的动物室内饲养。经黑龙江中医药大学实验动物管理和使用委员会审核，符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》和《实验动物使管理和使用委员会章程》的相关规定，实验动物伦理审查批准（伦理审批号：DWLL20151108003）。

1.1.2 药物 肠愈宁颗粒的配制肠愈宁颗粒由黄连、苦参、白头翁、椿根皮、白芍、炒白术、当归组成，由天江药业提供，系取固定基源、产地、规格、等级的道地药材，按中华人民共和国药典2015年版，采用水浸提法，经过滤、浓缩、喷雾干燥和制粒而成。

1.1.3 试剂与仪器 无水乙醇（天津永大化学试剂有限公司，批号：20130508）;三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司，美国，批号：SLBK1620V）;美沙拉嗪（爱的发制药集团，法国，批号：C14200623779）;苏木素-伊红（HE）染色液（南京建成生物科技有限公司，批号：618111）;高速离心机（科大创新股份有限公司，型号：KDC-16H）;荧光倒置显微镜（尼康公司，日本，型号：Y-FL 076652）;生物组织切片机（湖北欧美莱医疗科技有限责任公司，中国，OmL-QPA型）;微量分析天平（Sartorius公司，德国，型号：BSA224S-CW）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 UC动物模型的建立及给药48只雄性Wistar大鼠平均分成6组：空白对照组、模型组、肠愈宁高剂量组、肠愈宁中剂量组、肠愈宁低剂量组、美沙拉嗪对照组。除空白对照组给予等量生理盐水灌胃，其余各组大鼠禁食24 h后，以10%水合氯醛（4.0 mL/kg）腹腔注射麻醉，直径0.4 mm软管用石蜡油润滑，缓慢插入直肠，注入5%TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，然后将大鼠尾部提起倒置60 s。清醒后，自由饮水，造模后连续1周从体质量变化、大便性状、内脏敏感性、结肠病理等方面进行模型评价。造模7 d后随机抽取2只大鼠解剖，根据结肠组织病理切片观察到组织损伤变化，如有溃疡性结肠炎病理变化，提示造模成功，造模前后均给予大鼠高脂饮食。

1.2.2 给药方法 除空白对照组和模型组外所有的观察组均于造模次日（即第8天）给予相应药物灌胃，给药1次/d，连续14 d。腸愈宁高剂量组、肠愈宁中剂量组、肠愈宁低剂量组分别灌服相当于生药量为1 g/mL、2 g/mL、4 g/mL的肠愈宁顆粒溶液10 mL/kg。美沙拉嗪对照组灌服相当于生药量为0.2 g/kg MES悬浊液10 mL/kg。而空白对照组、模型组给予等量10 mL/kg生理盐水灌胃。于末次给药（即第31天）处死大鼠取材并进行疾病活动指数（Disease Activity Index，DAI）评分。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 一般情况及DAI评分 对大鼠进行处死之前，观察其精神状态、活动情况、毛发程度、粪便、体质量等情况并进行记录。参照文献评分标准[11]：DAI=（体质量下降分数+大便性状分数+便血分数）/3，对各组小鼠进行DAI评分，以评估疾病活动情况，评分越高则表示炎性反应越重。具体评分如下：体质量变化百分率（体质量不变为0，1～5为1分，5～10为2分，10～15为3分，大于15为4分）、大便性状（正常状态为0，性状松散为2分，腹泻为4分）和大便隐血（正常0分，隐血状态为2分，肉眼血便为4分）。

1.2.3.2 结肠长度变化及结肠黏膜损伤指数（Colon Macroscopic Damage Index，CMDI）评分 处死大鼠，沿纵轴剪开肠腔，取出大鼠全段结肠，予生理盐水洗净并且平铺于滤纸上固定，测量长度并记录。使用放大镜肉眼观察黏膜损伤情况，依据下面的评分标准进行大体评分[12]：结肠无损伤为0分;黏膜充血、水肿，未出现溃疡为1分;黏膜充血、水肿伴随轻度糜烂，未出现溃疡为2分;黏膜充血、水肿伴随中度糜烂，伴有单个溃疡为3分;黏膜充血、水肿伴随高度糜烂，伴有多个溃疡为4分;黏膜充血、水肿伴随重度糜烂，伴有>1 cm的溃疡为5分。

1.2.3.3 HE染色观察结肠变化及组织损伤指数评分（Tissue Damage Index，TDI） 在大鼠结肠部位剪取约0.5 mm×2.0 mm大小组织条，置于4%多聚甲醛溶液中室温固定24 h，经乙醇脱水及二甲苯透明后进行石蜡包埋，连续切片5张，HE染色，光学显微镜观察结肠组织黏膜变化。记录结肠组织炎性反应、损伤程度和溃疡面积。HE染色病理评分标准参照以下标准进行评分[13]：炎性反应程度，无炎性反应，0分;轻度炎性反应，1分;重度炎性反应，2分。病变深度：无病变，0分;病变侵及黏膜下层，1分;病变侵及肌层，2分;病变侵及浆膜层，3分。隐窝损伤：无损伤，0分;基底1/3隐窝被破坏，1分;基底2/3隐窝被破坏，3分;全部隐窝和上皮被破坏，4分。病理评分=炎性反应+病变深度+隐窝损伤评分。

1.2.3.4 ELISA血清检测 治疗结束后，各个分组的大鼠禁食24 h后称其体质量，麻醉后采用腹主动脉法采集大鼠全血于促凝管中，静置2 h后3 500 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，分离血清后按照试剂说明书检测血清中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。当资料满足正态分布且组间方差齐同时，应用单因素方差分析;如不满足上述条件则采用非参数检验（秩和检验）方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UC大鼠的一般情况和DAI评分 空白对照组大鼠的评分为0并且一般状况良好，表现为反应快，毛发光滑，二便情况和体质量正常等。而模型组表现为反应迟钝，行动迟缓，毛色灰暗，粪便黏液状且有隐血及血便的情况，体质量下降。肠愈宁高剂量组和肠愈宁中剂量组以及美沙拉嗪组大鼠在用药后情况有明显好转，逐渐恢复与空白对照组大鼠性状相似，表现为精神状况，毛发，粪便及体质量均恢复正常。肠愈宁低剂量组大鼠在用药后在精神状况，毛发，粪便及体质量等方面均有好转，但是效果不如其他3组明显（P<0.05）。按照规定的评分标准给予评分。见表1。

2.2 对UC大鼠结肠长度及大体形态评分的影响 所有分组的大鼠在给药1周后处死，取结肠组织部位观察并且测量结肠长度并记录。与空白对照组比较并且在肉眼观察下，模型组部分组织与结肠有粘连，明显可见结肠黏膜充血水肿且伴有糜烂甚至出血，病灶部位结肠长度明显缩短，大体形态评分增高。与模型组比较，肠愈宁高剂量组、肠愈宁中剂量组和美沙拉嗪组大鼠有明显好转，少见充血水肿，基本未见糜烂及出血且结肠长度较长，大体形态评分降低。肠愈宁低剂量组表现为部分组织与结肠有粘连，有部分结肠黏膜充血水肿且伴有糜烂甚至出血，结肠长度仅长于模型组。见表2。

2.3 肠愈宁颗粒对UC大鼠HE染色结肠组织及TDI的影响 空白对照组大鼠结肠黏膜完整，腺体排列整齐，黏膜下组织无损伤，无其他表现。模型组与空白对照组比较，肠黏膜损失重，肠黏膜下组织破损且明显出现溃疡及糜烂现象，病理评分升高。肠愈宁高剂量组和肠愈宁中剂量组以及美沙拉嗪对照组大鼠在给药治疗后黏膜病理变化明显减轻，病理评分降低。肠愈宁低剂量组大鼠病理变化稍有好转，病理变化仅强于空白对照组，病理评分仅高于空白对照组。见图1、表3。

2.4 肠愈宁颗粒对UC大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-4表达的影响 与空白对照组大鼠比较，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达显著升高，抗炎因子IL-4的表达明显降低。肠愈宁高剂量组、肠愈宁中剂量组和美沙拉嗪对照组大鼠IL-4含量明显高于模型组，IL-1β、TNF-α含量较模型组显著下降。见图2。

3 讨论

溃疡性结肠炎是指由多种原因引起的结肠炎性反应性病变。其发病原因是多方面的，可以由细菌、真菌、病毒、寄生虫等生物引起[14]。目前治疗UC的药物如：泼尼松、泼尼松龙。上述药物均存在停药后易复发、长期使用不良反应大的问题。一些西药在治疗疾病的过程中还会造成结肠内菌群紊乱，导致菌群的严重失衡进而加重病情。在用药或者手术中保留灌肠的方式，患者的依顺性很差治疗过程痛苦麻烦。中医中药经过临床实践，通过对UC辨证分型论治，在临床中取得较好疗效，疾病复发率低，不良反应，所以临床上使用中医药治疗的患者越来越多，特别是早期和慢性UC患者，因此近几年，中药治疗溃疡性结肠炎逐渐引起了重视。

肠愈宁方由黄连、苦参、白术、白头翁、椿根皮、白芍、当归7味药物组成，从中医角度来说溃疡性结肠炎是湿热下注大肠，搏结气血，酿为脓血，肠道气滞则腹痛、里急后重、下痢赤白黏冻，肛门灼热;小便短赤，苔多黄腻，脉象弦数等而显现的湿热内蕴之象。肠愈宁方中黄连、白头翁性味苦寒，功擅清热燥湿解毒，以除致病之因，入大肠经，为君药。苦参、椿根皮祛湿凉血助君药清湿热积滞，为臣药。芍药养血敛阴，配以当归活血，体现了“行血则便脓自愈”之义。白术味甘、微苦，健脾益气，补中燥湿，止渴生津，最益脾精，大养胃气，升清阳而消水谷，能医泄痢，三者共为佐药。肠愈宁方可有效改善患者免疫功能和肠道运动功能，疗效良好，具有清热解毒、燥湿健脾功效，患者的临床症状能够得到有效的改善，同时也能够促进患者机体内平衡的稳定，且患者复发状况能够明显减少，所以，进一步研究肠愈宁颗粒治疗UC的作用机制是很有意义的。

本研究采用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇复合灌肠法建立UC大鼠模型，造模1周后，我们发现模型组大鼠首先在性状方面发生变化，表现为反应迟钝、懒动、毛色晦暗、体质量减轻、粪便出现隐血甚至出现便血的情况。取出大鼠结肠部分观察发现，模型组大鼠结肠长度缩短并且和部分组织有粘连，结肠黏膜出现充血水肿，经HE染色发现结肠黏膜受损严重，结肠黏膜下组织出现溃疡且糜烂的现象。而在使用肠愈宁颗粒中剂量或高剂量后可明显改善这些症状，大鼠呈现活泼好动、毛色光泽、粪便正常以及体质量减轻明显好转的趋势，此外，肠愈宁高剂量和中剂量组大鼠结肠黏膜充血水肿的症状明显好转，溃疡和糜烂的程度减轻，结肠黏膜受损修复，DAI、CMDI和TDI评分显著下降。该结果表明肠愈宁颗粒对溃疡性结肠炎大鼠有一定的治疗作用。

IL-1β是一种由单核巨噬细胞产生的致炎因子，Cao等[15]认为UC的发生可能是由于IL-1β誘导H2O2的释放，从而影响Ca2+的释放，导致UC患者结肠平滑肌功能障碍。TNF-α是一种促炎递质，参与体内的细胞免疫反应[16]，可被看作是评估UC严重程度的指标[17]。抗炎因子IL-4是II型辅助T细胞（Th2细胞）分泌的细胞因子，Mittal等[18]认为在维持肠道免疫以及抑制和消除肠道炎性反应方面，IL-4起着关键作用。在本实验研究过程中我们发现，IL-1β、TNF-α、IL-4的表达水平高低是根据分组的用药情况来不断变化的，模型组大鼠在经TNBS诱导后，TNF-α和IL-1β的含量明显上升，IL-4的含量显著下降，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。同模型组比较，在肠愈宁高剂量组、肠愈宁中剂量组和美沙拉嗪对照组的UC大鼠生存条件明显改善，大鼠血清中TNF-α和IL-1β蛋白的表达水平显著降低，IL-4表达升高，尤其以高剂量组肠愈宁颗粒的作用显著。这表明UC的发展和产生与肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-1β（IL-1β）3种蛋白的表达有密切的关系，也揭示了肠愈宁颗粒治疗UC的机制可能是通过非选择性抑制TNF-α和IL-1β的表达并且提高IL-4的表达从而增加其抗炎效果来实现的。

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（2020-03-17收稿 責任编辑：王明）