猪流行性腹泻病毒邹平分离株S1基因的遗传进化分析

李天芝，于新友，李 峰

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性接触性肠道传染病[1]。主要表现为水样腹泻、呕吐，7日龄内仔猪死亡率可达100%。PED以粪-口水平途径传播为主，是危害养猪场最严重的疾病之一，传播速度快，短时间内猪场可反复发病。2010年冬季，PED在我国大面积暴发[2]，毒株由传统G1型变为G2型，病毒毒力增强，对哺乳仔猪危害严重。自2013年美国暴发PED，PED在全球范围广泛流行，且流行毒株主要以G2型变异毒株为主。

PEDV属于冠状病毒科甲型冠状病毒属，基因组为单股正链RNA病毒，大小约28 kb，包含5′非翻译区、3′非翻译区，7个开放阅读框，编码复制酶多聚蛋白 1ab、纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）等多种不同蛋白[3]。其中S蛋白是与病毒入侵宿主细胞紧密相关一种糖蛋白，S蛋白被剪切为S1和S2两个亚基。S1亚基与受体的结合有关，也是诱导产生中和性抗体的主要区域，氨基酸的插入和缺失也主要发生在这一区域。S1基因在遗传进化上具有较高的变异性[4]，毒株变异情况可通过对S1基因变异分析获得。根据S1基因序列差异PEDV可分为G1经典毒株和G2变异毒株两个大的进化分支，其中G1又可分为两个进化亚支G1a和 G1b，G2可分为 3个进化亚支 G2a、G2b和G2c，当前主要流行毒株为G2b毒株[5]。本研究对邹平某猪场疑似PEDV感染肠道内容物样本检测，经RT-PCR扩增S1基因序列、测序，并与GenBank公布基因序列进行比对分析，旨在了解邹平猪场PEDV最新流行毒株变异情况，为疾病防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料

病料为2020年4月采自山东邹平某规模猪场疑似PEDV感染的猪肠道及内容物等。

1.2 试剂及试剂盒

Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司，猪流行性腹泻病毒核酸荧光RT-PCR检测试剂盒由山东绿都生物科技有限公司动物疫病检测事业部研制，pMD18-T vector、Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 等购自宝生物工程（大连）有限公司，DL 2 000 Marker、多功能DNA纯化回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司，其它化学试剂如异丙醇、乙醇等，均为国产分析纯产品。

1.3 引物合成

应用DNAStar软件对GenBank中收录的PEDV S1基因比对分析，并利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，预期扩增目的基因片段大小为2 257 bp，引物序列为 F：5′-CTACCACAAGATGTCA CCAGGT-3′，R：5′-GGCCAGACTGAGATGGGACGTA G-3′，引物由通用生物系统（安徽）有限公司合成。

1.4 病料样品检测

采集水样粪便或取糊状粪便加适量生理盐水稀释，12 000 r/min离心5 min，取上清液，按照Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书提取病毒核酸样品。按猪流行性腹泻病毒核酸荧光RTPCR检测试剂盒说明书对制备的核酸进行检测。

1.5 PEDV S1基因序列扩增

首先用无核酸酶灭菌纯化水分别稀释引物F和R，使得其终浓度均10 μmol/L，随后，以提取的PEDV核酸RNA为模板，进行RT-PCR反应。按照One Step RT-PCR Kit Ver.2说明书进行反应体系的配制，总体系 25 μL，其中 2×1 Step Buffer 12.5 μL，Prime ScriptTM1 step Enzyme Mix 1.0 μL，F 1.0 μL，R 1.0 μL，模板量 2.5 μL，灭菌纯化水 8.0 μL 瞬时离心后，放入PCR仪进行扩增反应。扩增反应程序为：50℃反转录30 min；95℃预变性2 min；95℃变性40 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸 2 min。

1.6 PCR扩增产物的检测及序列比对分析

取PCR产物电泳检测，观察扩增结果，切下目的条带，按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作进行回收。回收产物与pMD18-T连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养后，挑取单菌落摇菌过夜，按质粒提取试剂盒的说明书抽提培养菌液的质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果与GenBank中参照的PEDV S1基因序列进行比对分析。

2 结果

2.1 病原检测结果

以提取的病毒核酸为模板，进行PEDV荧光RT-PCR检测，结果显示，导致猪场仔猪腹泻的病原为PEDV。

2.2 PEDV S1基因扩增产物的检测

用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果在2 257 bp左右出现扩增DNA条带（图1），和预期大小一致。

2.3 PEDV S1基因测序及序列分析

测序结果显示，PEDV邹平分离株S1基因大小为2 257 bp。从GenBank中下载PEDV各进化分支不同代表毒株，用DNAStar软件进行分析，构建进化树（图2），结果显示，分离毒株在PEDV G2b分支。PEDV邹平分离株与G1分支参考毒株核苷酸同源性为89.5%～92.2%，与G2分支参考毒株核苷酸同源性为94.7%～98.7%，与经典疫苗毒株CV777核苷酸同源性仅为89.7%。与韩国和日本经典疫苗毒株DR13和83P-5核苷酸同源性为89.8%和89.7%。PEDV邹平分离株S1基因推导其氨基酸与疫苗株CV777相比存在5个氨基酸（58～59位之间插入氨基酸QGVN）的插入和2个氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸（DG）。

3 讨论

我国于1976年有流行性腹泻病例的相关报道，并于1982年实现了PEDV在肠组织原代单层细胞上传代培养。PEDV首次出现后在我国猪场一直持续存在，但对猪的危害并不是特别严重，主要为大猪一过性腹泻，采用经典CV777毒株制备疫苗，猪场PED得到很好的控制。自2010年开始，PEDV病毒发生变异，毒株毒力增强，迅速蔓延全国大部分猪场，哺乳仔猪死亡率高达100%，猪场损失严重。

2020年4月邹平某规模猪场哺乳仔猪发生腹泻，死亡率较高，通过临床表现和剖检病变疑似发生猪流行性腹泻，采集病料送实验室进行猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR检测，结果确诊为PED。PEDV基因组遗传衍化分析显示，S1基因为高变区，其变异在一定程度上代表了整个基因组的变异特征，S1基因是PEDV关键毒力基因，含有的中和抗原表位，不同毒株S1基因的插入、缺失会间接导致病毒毒力和免疫原性等一系列改变[6]，自2010年以后PEDV流行毒株由经典的G1型变为变异型G2型，G1经典毒株进化亚支G1a主要是弱毒疫苗株及其衍生毒株，G1b主要是传统意义上认为的田间流行经典野毒株。G2变异毒株进化亚支G2a主要是 2010—2013年分离毒株，G2b主要是 2016—2019年分离的流行毒株，也是当前主要流行毒株，G2c亚支则为重组毒株。为了解猪场PEDV流行毒株变异情况，对PEDV邹平株S1基因进行克隆测序，并用DNAMan软件进行遗传进化分析，以了解猪场流行毒株的S1基因遗传变异特点，旨在为猪场PEDV疫苗的选择提供一定参考依据。本研究所获得的PEDV邹平株序列则属于G2b进化分支，这对于邹平地区PED的分子流行病学监测和防控具有重要意义。

猪流行性腹泻无有效药物治疗，只能以疫苗预防为主，然而免疫接种经典PEDV毒株疫苗的猪场也常有PED发病，推测由于PEDV流行毒株发生变异，传统基因型疫苗毒株防控效果不理想所致，因此，选择当前流行毒株制备疫苗是防控PED的关键。猪场发病后除紧急接种适宜毒株疫苗外，还应该加强饲养管理，饲喂全价配合饲料，保证猪舍适宜的温度和湿度，饮水清洁卫生，定期清理卫生，加强消毒，无害化处理病死猪，开展灭蚊蝇灭鼠工作，做好后备猪驯化及常规疫苗免疫接种工作等综合性防控措施。