水飞蓟素调控信号传导及转录活化子3逆转乳腺癌耐药性的研究

袁修翠，刘曙光

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤。据统计，我国每年女性乳腺癌发病16.9万例，是女性第二大常见恶性肿瘤。在我国，约有4.5万女性死于乳腺癌，在恶性肿瘤引发的死亡中排第六位[1]。乳腺癌是实体瘤中应用化疗最有效的肿瘤之一，但由于多药耐药(multidrug resistance，MDR)现象的存在往往会造成化疗的失败，降低了抗癌药物的临床疗效[2]。克服MDR 的方法之一是使用逆转剂，但是逆转剂的生物利用率低或易引发严重的不良反应，导致其在临床上的应用举步维艰[3]，因此寻找高效、低毒的耐药逆转剂是当前乳腺癌治疗的研究热点。

目前，越来越多的证据显示信号传导及转录活化子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和乳腺癌的MDR密切相关[4]。因此，本实验探究了水飞蓟素(Silibinin)是否可通过调控STAT3来调控乳腺癌耐药性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)、0.25%胰蛋白酶剂购自美国BI公司，人乳腺癌细胞株MCF-7购自中科院上海细胞库，MCF-7/ MDR 细胞购自中南大学高等研究中心；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁生物公司；总RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒及QPCR试剂盒购自康为试剂；阿霉素和水飞蓟素购自深圳万乐药业；STAT3和p-STAT3(Ser727)一抗购自美国Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 一抗购自Proteintech公司；二抗购自中杉金桥；流式细胞仪为美国BD公司产品；STAT3-siRNA和过表达质粒均购自美国Origene公司。水飞蓟素干粉先用DMSO 溶解为500mg/ml 的工作母液(DMSO 在无毒剂量内)，分装后避光保存于-20 ℃冰箱，使用时用培养液配成相应浓度应用液。

1.2 细胞培养 将乳腺癌细胞株MCF-7培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，在37 ℃、CO2含量为5%的细胞培养箱内培养。相应耐药株MCF-7/MDR连续培养在含1.0 μg/ml的阿霉素的上述培养液中，培养条件相同。

1.3 细胞内总RNA的提取和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-QPCR) 按照康为试剂RNA提取试剂盒说明书进行细胞内总RNA的提取，随后利用逆转录试剂盒按照相应的说明在冰上进行操作。RT-QPCR用来检测细胞和组织内STAT3的表达。反应条件：94 ℃，60 s，热变性：90 ℃，15 s，60 ℃，60 s，循环扩增40次；最后进行溶解曲线分析。每个样本设3个复孔，产物根据溶解曲线进行分析，以排除是否有引物二聚体的干扰。以达到阈值的最低循环数(Ct值)计算样本中的mRNA的相对量。以GAPDH作为内参，计算作为样本中的相对表达丰度，用2-△△Ct方法计算STAT3在结肠癌细胞中的表达，引物序列为：STAT3： 5’-AGCAGCACCTTCAGGATGTC-3’(forward)，5’- GCATCTTCTGCCTGGTCACT-3’ (reverse)；GAPDH，5’-TTGCCCTCAACGACCACTTT-3’(forward)，5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ (reverse)。

1.4 Western Blotting检测STAT3、p-STAT3 蛋白表达 利用RIPA裂解液提取MCF-7及MCF-7 /MDR 细胞内的总蛋白，并用BCA法对蛋白进行定量，后将其置于100 ℃金属浴中孵育8 min进行蛋白变性。每个样品取20 μg行SDS-PAGE 电泳并转膜，剪下含目的条带的PVDF 膜，置于含5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，STAT3、p-STAT3、GAPDH 一抗4 ℃过夜孵育相应条带。TBST清洗3次，室温孵育二抗1 h，TBST清洗3次，ECL显色，胶片曝光。凝胶成像系统扫描后Image J软件分析条带灰度值。

1.5 CCK-8检测细胞毒性 (1)取对数生长期的转染STAT3-siRNA和STAT 3过表达的MCF-7/MDR细胞，按2×105/孔的密度接种于96孔板中，每个孔中加入100 μl 1640完全培养基，每个处理组设置5个复孔。(2)24 h 后加入不同浓度的阿霉素(耐药株终浓度分别为1、5、10、25、50、100 μg/ml，亲本细胞株终浓度分别为0.2、0.8、2、5、10、20 g/ml)，以未加阿霉素处理的细胞为对照组，药物处理48 h 后弃去培养基，然后用PBS缓冲液清洗3次，再在每孔加入100 μl的CCK8反应液(90 μl培养基+10 μl CCK8工作液)，随后将96孔板放入37 ℃培养箱中孵育3小时，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光值。计算阿霉素对耐药细胞的半数抑制量IC50。实验平行重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 Annexin V/PI双染法检测水飞蓟素和STAT3对各组细胞凋亡的影响。胰酶消化各组细胞并收集，用冷的PBS将其洗涤2次，500 μl binding buffer重悬细胞，向细胞悬液中加入5 μl Annexin V，室温孵育15 min，随后加入5 μl PI溶液，孵育5 min后于流式细胞仪检测。

1.7 统计学处理 运用SPSS 16.0统计软件对实验结果进行统计分析，所有结果采用均数±标准差(x±s)的方式表示，组间均数的比较采用独立样本t检验(双侧检验)。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STAT3在MCF-7/MDR耐药株中高表达 Western Blotting和QPCR实验结果显示，乳腺癌耐药株MCF-7/MDR中STAT3的蛋白水平和mRNA水平均较亲本细胞株MCF-7显著上升，见图1。

注：a为Western Blotting检测MCF-7和MCF-7/MDR中STAT3的表达；b为QPCR检测MCF-7和MCF-7/MDR中STAT3的表达图1 Western Blotting和QPCR检测MCF-7和MCF-7/MDR中STAT3的表达

2.2 STAT3增强乳腺癌亲本细胞株MCF-7的耐药性并抑制其凋亡 CCK-8和流式细胞凋亡术结果显示，同对照组相比，过表达STAT3后MCF-7细胞的IC50明显提高(图2a)，凋亡能力显著抑制(图2b)；Western Blotting结果显示，转染siRNA-STAT3显著降低了乳腺癌耐药株MCF-7/MDR中STAT3的表达水平，其敲除效率可达75% (2c)；CCK-8和流式细胞凋亡术结果显示，同对照组相比，下调STAT3后MCF-7/MDR细胞的IC50值显著降低(图2d)，凋亡能力显著增强(图2e)。

2.3 水飞蓟素逆转乳腺癌耐药株MCF-7/MDR的耐药性并促进其凋亡 乳腺癌耐药株MCF-7/MDR加入水飞蓟素48 h后收蛋白检测了水飞蓟素对STAT3表达的影响，Western Blotting结果显示水飞蓟素处理后STAT3的表达显著降低(图3a)；CCK-8和流式细胞凋亡术结果显示，同对照组相比，加入水飞蓟素后IC50值显著降低(图3b)，凋亡能力显著增强(图3c)。

注：a为CCK-8检测过表达STAT3后MCF-7的细胞毒性曲线及IC50；b为流式细胞凋亡术检测过表达STAT3后MCF-7细胞的凋亡情况；c为Western Blotting检测了STAT3的敲除效率；d为CCK-8检测敲除STAT3后MCF-7/MDR的细胞毒性曲线及IC50；e为流式细胞凋亡术检测敲除STAT3后MCF-7/MDR细胞的凋亡情况。MCF-7/MDR阿霉素终浓度分别为1、5、10、25、50、100 μg/ml，MCF-7阿霉素终浓度分别为0.2、0.8、2、5、10、20 μg/ml图2 STAT3增强乳腺癌亲本细胞株MCF-7的耐药性并抑制其凋亡

注：a、b为CCK-8检测加入水飞蓟素(10 μg/ml)后MCF-7/MDR的细胞毒性曲线及IC50；c为流式细胞凋亡术检测加入水飞蓟素(10 μg/ml)后MCF-7/MDR细胞的凋亡情况图3 水飞蓟素逆转乳腺癌耐药株MCF-7/MDR的耐药性并促进其凋亡

注：a为CCK-8检测不同处理组MCF-7/MDR的细胞毒性曲线及IC50；b为流式细胞凋亡术检测不同处理组MCF-7/MDR细胞的凋亡情况。STAT3-OE-NC为过表达STAT3对照组，STAT3-OE为过表达STAT3组，si-STAT3-NC为siRNA-STAT3对照组图4 水飞蓟素可通过调控STAT3的表达逆转乳腺癌耐药性并促进其凋亡

2.4 水飞蓟素可通过调控STAT3的表达逆转乳腺癌耐药性并促进其凋亡 CCK-8和流式细胞术结果显示，同只加水飞蓟素组相比，加入水飞蓟素同时过表达STAT3组MCF-7/MDR细胞的IC50值显著增大；只敲除STAT3组和既加入水飞蓟素又敲除STAT3组相比IC50值无显著性差异，较对照组均显著降低(图4a)；凋亡结果显示，同只加水飞蓟素组相比，加入水飞蓟素同时过表达STAT3组凋亡能力显著降低，只敲除STAT3组和既加入水飞蓟素又敲除STAT3组相比凋亡情况无显著性差异，较对照组均显著增增强(图4b)。

3 讨论

水飞蓟素是从菊科药用植物水飞蓟的种皮中提取出来的一种黄酮木脂素类化合物，主要成分是水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭等黄酮类物质。研究表明其具有促进胆汁分泌和消炎、保护肝脏、强抗氧化等作用[5]。近年来，研究发现水飞蓟素不仅可抑制乳腺癌，还可以逆转其多药耐药[6]，并呈现出多步骤、多靶点、全方位特点，增强机体细胞免疫功能，适合用于临床抗肿瘤药物的研发。但目前对于水飞蓟素逆转乳腺癌的多药耐药性的具体分子机制鲜有报道。本研究从水飞蓟素发挥作用的具体机制进行了较为深入的探究，研究结果显示，水飞蓟素可降低乳腺癌耐药株MCF-7/MDR对阿霉素的IC50值，促进细胞凋亡。

STAT3是存在于细胞质中的转录因子，可通过与酪氨酸磷酸化通道相偶联而被激活。磷酸化的STAT3 以二聚体形式并被转移至细胞核内并参与下游基因转录水平调控[7]。STAT3作为一种原癌基因，可调控Bcl-XL、Bcl-2、C-myc等与细胞增殖、凋亡密切相关的基因，进而促进肿瘤的发生及发展[8]。研究发现，STAT3 在乳腺癌组织中的异常激活是导致其产生化疗耐药的关键因素[9]。本研究发现，在乳腺癌耐药株MCF-7/MDR中STAT3的表达显著多于乳腺癌亲本细胞株MCF-7；STAT3可增加IC50值，抑制细胞凋亡。且同只加水飞蓟素组相比，加入水飞蓟素同时过表达STAT3组IC50值显著增大，凋亡受到明显抑制，si-STAT3组同水飞蓟素+si-STAT3组相比IC50值无显著性差异。以上结果均表明水飞蓟素可通过降低STAT3的表达逆转乳腺癌耐药性。