虎杖中白藜芦醇的提取工艺

崔 霖, 朱建星, 张万忠, 于海龙

(1. 沈阳化工大学 制药与生物工程学院, 沈阳 110142;2. 松桃苗族自治县民族中医院, 贵州 铜仁 554100)

0 引 言

虎杖(Polygonum cuspidatum),又名山茄子,金锁王等[1],是人们比较熟悉的中草药,可入药的部分主要是根和茎。因其中含有黄酮类、二苯乙烯类等许多成分[2-3],具有很高药用价值。白藜芦醇(Resveratrol,以下简称Res),是其中含量最多化合物之一,属于二苯乙烯类化合物[4]。具有复杂的生物成分,能抑癌、防氧化、消炎、抑菌[5]、降脂减肥、预防心血管和肝脏损伤,普遍用于食品药品、补充剂、外用护肤品范围,用途十分广泛。

现在从虎杖中提取并纯化Res的工艺比较繁多[6-12],提取方法主要有溶剂提取法、超声波辅助提取法、酶解提取法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取等,纯化方法主要有溶剂萃取法、大孔树脂吸附法、双水相萃取法、柱层析法、高速逆流色谱法等,结合实验环境和实验室条件,综合考虑本实验采用乙醇回流法和超声波辅助法从虎杖中提取Res,用Res的提取率为响应变量,开展单因素实验和正交实验,分析并作出工艺条件的改进。Res粗品通过乙醚溶剂萃取进行初步纯化,比较纯化前后Res的含量,再以其含量及回收率为研究对象,对大孔树脂吸附法纯化Res的工艺作改进实验。

1 实验材料与设备

虎杖(优质,西安善益堂药业有限公司)、称量纸(10 cm×10 cm郑州中天实验仪器有限公司)、无水乙醇(分析纯,无锡三合化工有限公司)、Res标准品(分析纯,中国药品生物制品鉴定所)、AB-8树脂(河北树脂工艺品生产厂)。

电子天平(FA22048沈阳拓宇衡器有限公司)、高速万能粉碎机(FW100 武汉华威化工仪器有限公司)、紫外∕可见分光光度计(UV1100翱艺仪器(上海)有限公司)、循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ武汉华威化工仪器有限公司)、旋转蒸发器(RE-2000B郑州生化仪器有限公司)、恒温水浴锅(HH-4辽宁赛亚斯科技有限公司)、数控型超声波清洗器(KQ5200DE郑州生化仪器有限公司)。

2 方 法

2.1 乙醇回流法单因素实验

将虎杖粗品经粉碎机打碎、筛滤得虎杖粉末。通过单因素实验,探究不同因素对提取率的作用,然后以4种不同因素作为变量:1) 乙醇浓度:取5份5.0 g虎杖粉末,对应放入烧瓶中,分别加入质量浓度为50%、60%、70%、80%、90%的50 mL乙醇,配置料液比为1∶10的虎杖-乙醇溶液,并充分摇匀。再在85 ℃水浴下,热回流2次,时间为2 h,合并2次的提取液,迅速利用循环水式真空泵抽滤后,得到提取液。将其分别用各自浓度乙醇定容至100 mL,取1 mL稀释1 000倍,在波长306 nm处测定Res的吸光值,以此计算Res浓度和提取率。2) 料液比:以料液比作为唯一变量,分别加入质量浓度为80%的乙醇25、50、75、100、125 mL,即原料与溶剂比例1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25。再按如上方法测定计算Res浓度和提取率。3) 回流时间:加入质量浓度为80%的乙醇溶液50 mL(原料与溶剂比例为1∶10),在85 ℃水浴下热回流2次,回流时间分别为1、2、3、4、5 h,再按如上方法测定计算Res浓度和提取率。4) 回流次数:加入质量浓度为80%的乙醇溶液50 mL(原料与溶剂比例为1∶10),分别在85 ℃水浴下热回流1、2、3、4、5次,回流时间均为2 h,再按如上方法测定计算Res浓度和提取率。设计正交实验,如表1所示。

表1 乙醇回流法提取Res正交实验因素水平Table 1 Horizontal design of orthogonal experimental factors for extracting Res by ethanol reflux method

2.2 超声波辅助提取法单因素实验

通过单因素实验,探究不同因素对提取率的作用,以4种不同因素作为变量:

1) 乙醇浓度:取5份5.0 g虎杖粉末,对应放入250 mL锥形瓶中,加入质量浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液100 mL(原料与溶剂比例为1∶20),并充分摇匀。在超声波清洗器中进行提取,温度恒定设为60 ℃,功率140 W,提取60 min,计算Res的浓度和提取率。2) 料液比:加入原料与溶剂比例分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的虎杖-乙醇溶液,并充分摇匀,按2.1(1)方法计算Res浓度和提取率。3) 超声功率:设定超声功率分别为80、100、120、140、160 W,按原料与溶剂比例1∶20加入质量浓度为80%的乙醇溶液(100 mL),充分摇匀,温度恒定设为60 ℃,提取60 min。按2.1(1)方法计算Res浓度和提取率。4) 提取时间:设定提取时间分别为40、50、60、70、80 min,按原料与溶剂比例1∶20加入质量浓度为80%的乙醇溶液(100 mL),充分摇匀,温度恒定设为60 ℃,功率140 W。按2.1(1)方法计算Res浓度和提取率。设计正交实验,如表2所示。

表2 超声波辅助法提取Res因素水平Table 2 Factor level design of Res extraction by ultrasonic assisted method

2.3 白藜芦醇提取率的计算

提取率P的计算,如计算公式(1):

(1)

式中,n为稀释的倍数;V为提取液的体积(mL);C为提取液的Res含量(μg/mL);W为虎杖粉末的质量(g)。

2.4 虎杖中白藜芦醇的纯化

2.4.1 溶剂萃取纯化

先采用醇沉除杂对Res提取液进行预处理,再用旋转蒸发器将其进行浓缩,以浓缩液无醇味为提取终点。向浓缩液中加入等体积比乙醇,将pH调节至2.0,静置15 h后,减压抽滤,得Res的粗提液[13-14]。

再用盐酸将Res粗提液的pH调至中性,减压浓缩,将经乙酸乙酯萃取3次的浓缩液上层液合并,经活性炭脱色、真空干燥,得到Res粗品,计算Res含量与收率。

ω=C×n×1 000

(2)

式中,ω为Res含量(mg/mL);C为Res质量浓度(μg/mL);n为稀释倍数。

(3)

式中α为Res纯度%;m1为纯化后粗品溶解液中Res质量(mg);m2为纯化后Res粗品质量(mg)。

(4)

式中,η为Res收率%;m3为纯化后Res的质量(mg);m4为纯化前Res的质量(mg)。

2.4.2 大孔吸附树脂纯化

将超声波清洗器制备的Res提取液萃取干燥,成品加蒸馏水溶解,得上柱液。先把AB-8树脂进行预处理[15],再把准备好的液上柱进行吸附(流速1 mL/min,循环2 h)。结束后,洗脱至中性,然后用70%质量浓度乙醇,将Res从柱上洗脱下来,隔5 min收集1次,测其吸光度值,作Res解析曲线,合并洗脱,并液,测量Res含量。然后进行减压浓缩,烘干即为Res化合物。

3 结果与分析

3.1 白藜芦醇标准曲线的绘制

称量5 mg的Res标准品,用无水乙醇定容至25 mL,可得质量浓度为0.2 mg/mL的溶液。然后吸取1 mL,定容至25 mL,即可得到标准品溶液(0.008 mg/mL)。再依次吸取其溶液0、1、2、3、4、5 mL用无水乙醇溶解,定容至10 mL,得到质量浓度分别为0、0.000 8、0.001 6、0.003 2、0.004 0 mg/mL的Res标准品溶液。用无水乙醇做比对,测定每份样品在波长为306 nm处的吸光值,做2组平行实验,取2组实验平均值。建立吸光度A对样品浓度C(mg/mL)的线性回归标准曲线,如图1和表3。

图1 Res标准曲线Fig.1 Res standard curve

表3 实验数据Table 3 Experimental data

回归方程为

A=0.099 5C+0.380 2、R2=0.997 3

(5)

3.2 乙醇回流法不同因素对提取率的影响

3.2.1 单因素对白藜芦醇提取率的影响

1) 乙醇浓度:按照2.2.1(1)的方法进行处理,结果如图2。

图2 乙醇浓度的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration

2) 回流时间:按照2.2.1(2)的方法进行处理,结果如图3。

图3 回流时间的影响Fig.3 Effect of reflux time

3) 回流次数:按照2.2.1(3)的方法进行处理,结果如图4。

图4 回流次数的影响Fig.4 Effect of reflux times

4) 料液比:按照2.2.1(4)的方法进行处理,结果如图5。

图5 料液比的影响Fig.5 Effect of material liquid ratio

由上图分析得,浓度70%时提取率达到波峰,其他值皆不理想。提取率与回流时间正相关,2 h后斜率突然变小。线性曲线变化趋势为先上升,提取2次后曲线趋于平稳。只有1∶10的原料与溶剂比例才可以将Res充分提取出来,除此之外效果都不理想,乙醇用量越多,溶解的杂质越多,导致提取率下降。由此可得,原料与溶剂比例1∶10,提取的Res最多。

3.2.2 正交实验结果

以提取率为响应参考,设计正交实验,正交实验结果如表4,方差分析表见表5。

表4 正交实验结果Table 4 Results of orthogonal experiment

表5 正交实验方差分析表Table 5 Analysis of variance of orthogonal experiment

由表4得,各变量对Res的提取率都有一定的作用,但强弱不一:A>B>C>D,其中最优条件为A2B2C3D3,即用70%浓度乙醇,1∶10的原料与溶剂比例时,每次2 h的回流3次。采用最优条件验证结果,其提取率达1.30%,好于之前结果,证明此工艺优化良好。

3.3 超声波提取不同因素对提取率的影响

3.3.1 单因素对白藜芦醇提取率的影响

1) 乙醇浓度:按照2.2.3(1)的方法对虎杖中Res进行超声浸提,测所得提取液吸光度值,计算Res提取率,绘制坐标图,结果见图6。

图6 乙醇浓度的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration

2) 提取时间:按照2.2.3(2)的方法对虎杖粉末进行超声浸提,测提取液吸光度值,计算Res提取率,绘制坐标图,结果见图7。

图7 提取时间的影响Fig.7 Effect of extraction time

3) 超声波清洗器功率:按照2.2.3(3)的方法对虎杖粉末进行超声浸提,测提取液吸光度值,计算Res提取率,绘制坐标图,结果见图8。

图8 超声功率的影响Fig.8 Effect of ultrasonic power

4) 料液比:按照2.2.3(4)的方法对虎杖粉末进行超声浸提,测提取液吸光度值,计算Res提取率,绘制坐标图,结果见图9。

图9 料液比的影响Fig.9 Effect of material liquid ratio

由图6可知,线性曲线趋势先升后降,也为提取率变化趋势,浓度低时,效果不理想,过高也不利于Res溶出,最佳条件80%。由图7可知,线性曲线变化趋势是先增大,提取时间60 min后曲线趋于平稳。由图8可知,功率120 W时提取率达到波峰,其他值皆不理想。由图9可知,原料与溶剂比例为1∶25时Res提取率接近峰值。

3.3.2 正交实验结果

以提取率为响应参考,设计正交实验,正交实验结果如表6,方差分析表见表7。

表6 正交优化实验结果Table 6 Experimental results of orthogonal optimization

表7 正交优化实验方差分析Table 7 Analysis of variance of orthogonal optimization experiment

通过上表的分析,实验中选定的变量对Res提取率影响存在差异,强弱为:A>D>B>C。当变量为A2B2C2D3时最佳,此时乙醇质量分数为80%,原料与溶剂比例1∶28,在超声波清洗器的功率为120 W的条件下提取60 min。其中变量A的影响效果显著,即乙醇浓度为影响作用最强的变量,符合正交结果。在A2B2C2D3因素下验证其结果,结果Res的提取率可以达到1.36%,好于之前结果,该工艺优化良好。

3.4 分离纯化实验

图10 Res洗脱曲线Fig.10 Res elution curve

3.4.1 溶剂萃取法分离纯化

分别使用以上2种方法确定的最佳优化工艺进行萃取。乙醇回流法得粗品88.25 mg,纯度60.04%;超声波辅助法得粗品76.37 mg,纯度74.98%。

3.4.2 大孔吸附树脂分离纯化

经减压后所得浓缩洗脱液中的Res含量为1.65 mg/mL,纯度由51.02%升至89.07%,纯化后得到干燥的Res化合物61.13 mg,收率95.09%。Res洗脱曲线如图10所示。

4 结 论

室温条件下,用乙醇回流法提取白藜芦醇,最佳工艺条件为70%浓度乙醇,原料与溶剂比例1∶10,回流3次,每次2 h,此时白藜芦醇提取率达1.30%。室温条件下,用超声波辅助法提取白藜芦醇的最佳工艺条件为80%浓度乙醇,原料与溶剂比例1∶28,在超声功率120 W的条件下浸提60 min,此时白藜芦醇提取率达1.36%。经过萃取和大孔树脂吸附后,能够使目标产物纯度提高明显,表明应用大孔树脂可对虎杖中白藜芦醇进行有效的纯化。