老年慢性心力衰竭病人锰超氧化物歧化酶Ala-9Val基因多态性与预后的相关性研究

闫生玲 屈丽娜 薛恩忠

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各种心脏疾病的终末发展阶段，主要表现为心室泵血或充盈功能低下，是心血管疾病病人丧失劳动力及死亡的重要原因。锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)重要的同工酶类型，主要存在于线粒体基质中，是机体最重要的抗氧化酶之一，参与维持机体自由基平衡。既往研究发现，CHF病人血清SOD活性显著降低，并与CHF病人病情严重程度密切相关[1-2]，提示氧化应激在CHF发生发展进程中发挥重要作用。Ala-9Val是近年来新发现的Mn-SOD基因多态性位点，本研究拟比较Mn-SOD基因Ala-9Val位点不同基因型CHF病人预后情况的差异，旨在探讨Mn-SOD基因多态性与CHF病人预后的关系，为临床工作提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 经本院伦理委员会审核批准，连续性选择2015年1月至2017年6月于我科住院治疗的老年CHF病人，纳入标准：(1)年龄≥60岁；(2)CHF诊断符合2014年中华医学会心血管病学分会制定的《中国心力衰竭诊断和治疗指南》[3]；(3)随访资料完整。排除标准：(1)合并各种心脏瓣膜病、先天性心脏病、心包疾病、心肌炎等；(2)合并恶性肿瘤，严重肝肾疾病者。本研究共选取CHF病人280例，其中男179例，女101例，年龄60～82岁，平均(68.06±6.98)岁。另随机从我院同期老年健康体检者中选择100例健康志愿者作为对照组，包括男60例，女40例，年龄60～79岁，平均(67.82±6.60)岁。2组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 基因多态性检测及分组:采用PCR-限制性片段长度多态性法(RFLP)检测Mn-SOD Ala-9Val基因多态性。采集清晨空腹外周静脉血，应用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取全血基因组DNA。严格按照PCR操作流程进行扩增，上、下游引物分别为5′-CAGCCCAGCCTGCGTAGACG-3′和5′-GCGTTGATGTGAGGTTCCAG-3′，均由上海生物工程有限公司合成。取延伸产物采用限制性内切酶BsaW Ⅰ进行酶切。最后，取酶切产物进行电泳，凝胶成像系统判定结果。如图1，有且只有1条88 bp电泳带为Ala/Ala基因型，有2条长度分别为88 bp和172 bp电泳带为Ala/Val基因型，有且只有1条172 bp电泳带为Val/Val基因型。根据既往研究中国人群Mn-SOD Ala-9Val位点基因型分布特点及本研究检测结果，将CHF组病人分为Val/Val亚组和Ala/Ala+Ala/Val亚组。

注：1，2：Val/Val；3，4：Ala/Val；5，6：Ala/Ala；M：marker图1 Mn-SOD基因Ala-9Val位点PCR-RFLP电泳图

1.2.2 其他临床资料收集:包括性别、年龄、BMI、吸烟史、高血压、DM及心肌梗死等疾病史，NYHA分级，BNP、血肌酐、估算的肾小球率过滤(estimated glomerular filtration rate，eGFR)等血液化验指标。此外，CHF病人均接受超声心动图检查，采集并记录LVEF及左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)等参数。

1.2.3 随访：以确诊CHF之日为随访起点，每3个月通过门诊或电话随访1次，至少随访3年，以心源性死亡(猝死、CHF加重死亡以及致死性心肌梗死)为随访终点，并以此将CHF病人分为死亡亚组和存活亚组。

2 结果

2.1 2组Mn-SOD Ala-9Val基因多态性比较 280例CHF病人中，Mn-SOD Ala-9Val位点Val/Val、Ala/Val和Ala/Ala基因型分别有227例(81.07%)，48例(17.14%)和5例(1.79%)，对照组分别为78例(78.00%)，19例(19.00%)和3例(3.00%)。2组基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义(χ2=0.747，P=0.688；χ2=0.696，P=0.404)。2组基因型分布经检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=1.651，P=0.438；χ2=1.727，P=0.422)，具有群体代表性。

2.2 不同基因型老年CHF病人一般临床特点比较 Val/Val亚组病人合并心肌梗死比例高于Ala/Ala+Ala/Val亚组(χ2=4.340，P=0.037)，2个亚组其他指标差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 不同基因型CHF病人临床资料比较

2.3 不同基因型老年CHF病人3年死亡率比较 280例CHF病人随访3年时间内失访19例，非心源性死亡6例，剩余255例，其中携带Val/Val、Ala/Val和Ala/Ala基因型病人分别为204例(80.00%)，46例(18.04%)和5例(1.96%)。255例CHF病人中共73例病人发生心源性死亡，Val/Val亚组和Ala/Val+Ala/Ala亚组分别有67例(31.86%)和6例(15.69%)，2个亚组3年死亡率比较差异具有统计学意义(χ2=8.872，P=0.003)。

2.4 老年CHF病人预后的影响因素分析 单因素分析显示，死亡亚组BMI、心肌梗死比例，NYHA Ⅲ～Ⅳ级比例、LgBNP和LVEDD水平高于存活亚组，eGFR和LVEF低于存活亚组，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。2个亚组间Mn-SOD基因Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率差异均具有统计学意义(χ2=9.056，P<0.05)。见表2。进一步Logistic回归分析显示，携带Val/Val基因型是老年CHF病人3年心源性死亡的独立危险因素(OR=1.759，95%CI：1.151～2.687，P=0.003)。

表2 不同预后CHF病人临床资料比较

3 讨论

越来越多研究证据表明,机体氧化应激水平失衡是CHF病人病情进展的重要因素[1-2,4]。SOD是一类广泛存在于生物体内的金属酶，人体中存在Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD和CuZn-SOD等多种同工酶形式，Mn-SOD主要分布于细胞线粒基质内，是机体最主要的自由基清除剂之一，对维持机体细胞氧化还原平衡至关重要。

人类Mn-SOD基因位于6q25上，Ala-9Val是目前研究最多的Mn-SOD基因单核苷酸多态性位点，可将Mn-SOD线粒体靶序列第9位的氨基酸由丙氨酸(Ala)替换为丝氨酸(Val)，进而导致信号肽构象由亲水的α-螺旋结构转变为疏水的β-折叠层结构，阻碍Mn-SOD在线粒体膜上转运，显著降低Mn-SOD活性。大量研究结果显示Ala-9Val位点多态性与多种疾病发生相关[5-6]。此外，既往国内外研究结果表明，不同地区、不同种族人群该位点基因型和等位基因分布频率存在显著差异，亚洲人群Ala等位基因分布频率显著低于欧洲人群。多数国外研究结果显示西方白种人Ala等位基因分布频率约为70%[7-8]。Lee等[9]在台湾地区人群中发现携带Ala等位基因(Ala/Ala+Ala/Val)者约占26.29%，张超贤等[10]以国人为研究对象的结果与之相似。本研究健康对照组携带Ala等位基因占22%，再次提示有必要在不同地区、不同种族人群中进一步开展该位点基因多态性研究分析。

本研究结果显示携带Val/Val基因型是老年CHF病人3年内发生心源性死亡的独立危险因素，提示基因型的差异可能会导致病人对缺血缺氧的耐受程度发生改变，干预心肌重构进程，影响病人预后，进一步验证了氧化/抗氧化系统失衡在CHF疾病进展中的关键作用。

综上所述，本研究发现Mn-SOD基因Ala-9Val多态性与老年CHF病人预后相关，Val/Val基因型可能成为预测老年CHF病人预后不良的新指标。本研究也存在不足之处：首先，本研究所纳入研究对象例数有限，尤以Ala/Ala基因型病人例数较少，所得到的结果可能存在偏差，期待后续多中心大样本研究结果进一步验证；其次，限于条件，本研究未就Mn-SOD活性进行检测，不能直接说明不同基因型病人Mn-SOD活性的差异；最后，Mn-SOD基因还存在其他多态性位点，它们与CHF预后的关系，以及各位点之间的相互关系有待继续研究。