柚皮苷对脂多糖刺激下成骨细胞碱性磷酸酶活性、骨保护素mRNA和RANKL mRNA的影响

秦红霞，张坦，郭春杰

(郑州大学第一附属医院 口腔科，河南 郑州 450000)

牙周炎的发展伴随着牙周支持组织的破坏，可造成牙槽骨吸收、牙周袋形成，甚至导致牙齿松动或拔除。菌斑微生物是牙周炎的始发因素。致病菌斑微生物通过与宿主发生免疫应答反应，破坏牙周支持组织。除了菌斑微生物及其代谢产物造成的破坏外，宿主对过强的免疫应答反应产生的抗炎因子也会对组织造成破坏，尤其对骨组织造成破坏。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，可直接作用于成骨细胞。LPS对MC3T3-E1细胞的抑制呈现浓度依赖性，随着LPS浓度的升高，对MC3T3-E1细胞的抑制作用越明显[1]。LPS能够明显抑制MC3T3-E1骨结节的形成以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性[2]。柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物。研究表明，柚皮苷不仅可以促进成骨细胞的增殖分化[3]，还可以抑制破骨细胞对骨的吸收[4]。但是目前关于柚皮苷抑制骨吸收的作用机制的研究较少。本实验通过LPS诱导MC3T3-E1细胞形成牙周炎的体外成骨细胞骨吸收模型，以不同浓度的柚皮苷为研究对象，采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测成骨细胞骨保护素(osteoprotegerin，OPG)mRNA和核因子κB受体活化因子配体(nuclear factor κB receptor activator ligand，RANKL)mRNA表达水平，旨在为临床医生使用柚皮苷治疗牙周炎和根尖周炎提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器柚皮苷(四川曼斯特生物科技有限公司)；LPS、CCK-8试剂盒(中国索莱宝)；MC3T3-E1细胞(中国医学科学院基础医学研究所)、α-MEM培养基、胎牛血清(北京全式金生物)；ALP活性检测试剂盒(中国碧云天)；RT-PCR试剂盒(日本Takara公司)；全波长酶标仪(美国Perking Eilmer公司)；PCR仪(Eppendorf mastercycler，德国)。

1.2 成骨细胞培养将原代MC3T3-E1细胞复苏，检测细胞密度达80%～90%后再进行传代培养，细胞离心后，将细胞悬液按1∶2进行传代，每隔2 d换液1次，取第3代细胞进行后续实验。标记部分细胞后放入液氮罐储存。

1.3 实验分组取传代后的MC3T3-E1细胞，以每孔1×104的密度接种于96孔板，每孔200 μL，培养24 h后，将细胞随机分为5组。空白对照组：加入等量的二甲基亚砜，未做其他处理。LPS组：加入终浓度为1 mg·L-1的LPS。低浓度组：加入终浓度为2 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。中浓度组：加入终浓度为10 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。高浓度组：加入终浓度为20 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。对低浓度组、中浓度组、高浓度组预先用1 mg·L-1的LPS处理2 h后，再各自加入相应浓度的柚皮苷溶液。

1.4 检测指标

1.4.1CCK-8检测成骨细胞增殖情况 将每组细胞均设6个复孔，在细胞培养箱里培养24 h后再按一定比例加入(每孔20 μL)CCK-8试剂，孵育2 h后用酶标仪在450 nm处测定吸光度。操作3次取平均值。

1.4.2ALP 将细胞接种至6孔板中过夜，待细胞长满70%～80%时开始加药，分组情况同1.3项。培养3 d后收取细胞，胰酶消化完将细胞分成3管。一管加入RIPA裂解液提取蛋白，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度值求算蛋白浓度。一管加入Trizol裂解液用来提取RNA。剩余一管用南京建成生物工程研究所的微量酶标法来检测培养细胞的ALP。胰酶消化细胞前先收集细胞培养液用来测定培养液的ALP，使用酶标仪在520 nm处测定各孔的吸光度。ALP活性=(待测样品吸光度值-空白样品吸光度值)/(标准品吸光度值-空白样品吸光度值)×标准品浓度/待测样品的总蛋白浓度。操作3次取平均值。

1.4.3RT-PCR检测成骨细胞OPG mRNA、RANKL mRNA的水平 取1.4.2项中加入Trizol裂解液的成骨细胞，提取成骨细胞总RNA。采用日本Takara公司的反转录试剂盒将细胞总RNA反转录成cDNA，使用荧光定量PCR仪测定，设置反应条件：95 ℃预变性30 s，随后95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共设置40个循环。操作3次取平均值。PCR引物序列由上海生工生物技术公司合成，见表1。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1 柚皮苷对成骨细胞增殖能力和ALP活性的影响与空白对照组比较，LPS组成骨细胞增殖能力和ALP活性均较低(P<0.05)。低浓度组、中浓度组、高浓度组的成骨细胞增殖能力和ALP活性均高于LPS组(P<0.05)。低浓度组成骨细胞增殖能力和ALP活性均高于中浓度组和高浓度组，中浓度组成骨细胞增殖能力和ALP活性均高于高浓度组(P<0.05)。见表2。

表2 柚皮苷对成骨细胞增殖能力和ALP活性的影响

2.2 柚皮苷对成骨细胞OPG mRNA和RANKL mRNA的影响(1)LPS组OPG mRNA表达水平低于空白对照组(P<0.05)。低浓度组、中浓度组、高浓度组OPG mRNA表达水平均高于LPS组(P<0.05)。低浓度组成骨细胞OPG mRNA表达水平高于中浓度组和高浓度组，中浓度组成骨细胞OPG mRNA表达水平高于高浓度组(P<0.05)。(2)LPS组RANKL mRNA表达水平高于空白对照组(P<0.05)。低浓度组、中浓度组、高浓度组RNAKL mRNA表达水平均低于LPS组(P<0.05)。低浓度组成骨细胞RNAKL mRNA表达水平低于中浓度组和高浓度组，中浓度组RNAKL mRNA表达水平低于高浓度组(P<0.05)。见表3。

表3 柚皮苷对成骨细胞OPG mRNA和RANKL mRNA的影响

3 讨论

牙周炎是常见的口腔感染性疾病。在全国第四次口腔健康检查中，中国有80%～96%的成年人存在不同程度的牙周问题。牙周炎是引起成年人牙齿丧失的主要原因。牙周炎不仅影响着人类的口腔健康，还与全身多种疾病的发生息息相关，如糖尿病、心血管疾病以及癌症等。

LPS是破坏骨组织及诱发炎症反应的关键因素，不仅会刺激炎症因子的释放，还能抑制牙周膜干细胞分化，导致牙槽骨吸收甚至增加牙周炎的发病率。LPS会激活成骨细胞NF-κB信号通路。据报道，向骨折小鼠腹腔注射LPS可以使骨折延期愈合[5]。这表明LPS可以直接抑制成骨细胞的分化。在本实验中，在1 mg·L-1的LPS刺激下，成骨细胞增殖能力下降，ALP活性降低，OPG mRNA水平下调，RANKL mRNA水平上调。这表明1 mg·L-1的LPS可直接抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。

柚皮苷是从天然药物和水果中分离提纯出来的一种RANKL抑制剂。近些年关于柚皮苷对骨代谢和骨形成的影响已经受到广泛的关注。人羊水源性干细胞是一种新型的治疗骨疾病的成骨细胞。Liu等[6]用柚皮苷刺激人羊水源性干细胞，结果发现柚皮苷不仅可以促进人羊水源性干细胞增殖分化，增加ALP活性，还可以通过BMP和Wnt/β-catenin信号通路来增加OPG表达、抑制RANKL表达，进而促进人羊水源性干细胞成骨分化，抑制其向破骨细胞分化。在本实验中，加入柚皮苷后可促进成骨细胞增殖，提高ALP活性，提升OPG mRNA水平，降低RANKL mRNA水平。RANKL是TNF配体家族成员，当RANKL与破骨细胞表面的RANK结合时，破骨细胞的分化和功能增强，从而发生骨吸收[7]。OPG被称为破骨细胞抑制剂，可由成骨细胞产生，RANKL和OPG的相对比值被认为是调节破骨细胞生物学和骨吸收的决定性因素和最终步骤，而且这一比值受到各种成骨激素、细胞因子和药物的调节[8]。这表明柚皮苷溶液通过刺激成骨细胞OPG mRNA的表达，抑制RANKL mRNA的表达，导致OPG/RANKL比值升高，进而体现了柚皮苷对骨吸收的抑制作用，这与现有的研究结果[9]一致。Li等[10]用2、4、8、10、20 mg·L-1柚皮苷处理MC3T3-E1细胞，结果显示不同浓度的柚皮苷均可促进成骨细胞增殖，提高ALP活性，2 mg·L-1柚皮苷的成骨作用最显著，随着柚皮苷浓度的升高，成骨促进作用变小。这与本实验结果一致，即当柚皮苷浓度为2 mg·L-1时，抑制骨吸收的作用最明显。

综上所述，柚皮苷可降低LPS刺激下成骨细胞RANKL mRNA水平，上调OPG mRNA水平，进而抑制骨吸收，并且当柚皮苷的浓度为2 mg·L-1时的效果最显著。这对临床医生使用柚皮苷治疗根尖周炎和牙周炎提供了理论依据。