板栗壳原花青素-介孔二氧化硅纳米颗粒复合体的制备工艺优化

王鑫，李浩楠，郑丽婷，雷嗣超，涂芬，董锡鹏，杨芳

（武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉 430205）

板栗（Castanea mollissimaBlume）属于壳斗科栗属坚果类植物[1]。从2011 年起，我国板栗种植面积稳居世界首位，产量约占世界总产量的60%[2]。作为板栗食品加工的副产物，板栗壳一般作为燃料或直接丢弃，造成资源的浪费。板栗壳中含有色素、有机酸、多酚类、多糖（或苷类）和鞣质等化学成分[3]，其中含有的具有抗氧化活性成分原花青素（Procyanidins，PC）含量为40.23 mg/g[4]。原花青素具有较强的清除自由基和抗氧化、改善心血管疾病、抗癌、抗辐射和抗病毒等[5-8]生物活性。

PC 在体内消化过程中，容易受到消化液酸碱度、热、过渡金属离子、单线态氧以及自由基等的影响而降低其结构稳定性和生物活性[5]；而将其负载于纳米载体中，可提高其生物利用率。在常用纳米材料中，介孔二氧化硅纳米颗粒具有高稳定、比表面积大、孔径和孔道均可调节、易于修饰的内外表面以及良好的生物相容等特点[6]，作为药物载运和可控释放材料，广泛应用于生物医药领域，尤其是在药物缓释方面发挥着越来越重要的作用[7]。然而，目前这些纳米载药系统面临着结构和工艺复杂等难题，载体的特性与结构对负载效果影响较大，需要针对不同被负载物进行研究，才能满足“安全、有效和质量可控”的三大原则[8]。本文在提取板栗壳PC 的基础上，将其负载于介孔二氧化硅颗粒中，并对负载工艺进行优化，为提高PC 生物利用率提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

板栗2019 年秋产自湖北省罗田县，选择成熟、新鲜、未破损的板栗，将人工剥除的板栗壳放入保鲜袋内，封口后低温保存。儿茶素标准品（C114051），购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；香兰素、无水乙醇、无水甲醇、浓硫酸等，分析纯，购于国药集团公司。

1.2 仪器与设备

V-5100 可见分光光度计、TG16-WS 台式高速离心机，上海元析仪器有限公司；高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；SHZ-D3 循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限责任公司；旋转蒸发器（RE-2000A），上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 板栗壳PC 的提取

将板栗壳洗净并干燥，粉碎后过60 目筛。采用1:15（g/mL）料液比，70%乙醇-水混合溶剂浸提板栗壳PC[9]，将提取液真空抽滤，并在40 ℃条件下真空浓缩，冷冻干燥，称量质量，在低温下保存，备用。

1.3.2 板栗壳提取物PC 含量的测定

（1）标准曲线

分别配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 儿茶素标准品溶液，采用硫酸-香草醛比色法[10]，得到PC 的质量浓度X和吸光度Y的标准回归方程：Y=1.485X-0.001 6，R2=0.9995 mg/mL。

（2）板栗壳提取物PC 含量的测定

称量板栗壳粗提物冻干粉，配制成一定浓度的样品溶液，采用硫酸-香草醛比色法，将吸光度值代入上述标准回归方程中，得到PC 的质量浓度，根据式（1）计算PC含量。

式中，c为板栗壳提取物PC 质量浓度，mg/mL；V为定容的试样体积，mL；m为称取的板栗壳提取物质量，g；N 为稀释倍数。

1.3.3 MSNs 载体的制备

采用气溶胶法制备MSNs[11]。通过氮气发生器将空气压缩、冷冻干燥制备氮气。称取4.0 g 四乙氧基硅烷（teraethoxysilance，CTAB）依次加入1.12 g、1 mol/L 盐酸溶液、22.8 g 无水乙醇、56 g 蒸馏水、10.4 g 十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium brmide，TEOS）、4.0 g NH4Cl，搅拌均匀，得到前驱体溶液。用雾化器将配制好的前驱体溶液以氮气作为载体生成气溶胶液滴，于管式炉中400 ℃凝固，得到白色的颗粒。将白色颗粒在500 ℃、煅烧5 h 除去CTAB 和NH4Cl，得到MSNs 载体。

1.3.4 MSNs 的透射电子显微镜（TEM）分析

采用TEM 对MSNs 的孔道结构及孔径进行分析[12]，将MSNs 用无水乙醇溶解后，采用超声波进行分散，将样品溶液沉积到镀有碳膜的铜网上，于45 ℃干燥2 h 后进行抽真空处理，在加速电压200 kV 下观察。

1.3.5 MSNs 负载板栗壳PC 的单因素试验

（1）PC 浓度对负载率的影响

称取0.005 g MSNs 于1.5 mL 离心管中，加入1 mL浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的PC 溶液。对该体系进行变温交替处理，即在30 ℃和4 ℃分别交替处理0.5 h。样品于30 ℃处理0.5 h，记为1 次变温处理，再于4 ℃处理0.5 h，此为2 次变温处理，取出后于30 ℃处理0.5 h，为3 次变温处理。本试验变温交替处理次数为3 次。变温交替处理完成后以8 000 r/min 转速离心15 min，收集上清液，采用硫酸-香草醛法测量上清液的吸光度值，根据公式（2）计算负载率。空白组为不加MSNs，其余同上。

式中，A1为上清液在500 nm 处的吸光度值，A0为空白组上清液在500 nm 处的吸光度值。

（2）MSNs 添加量对负载率的影响

分别称取0.001、0.003、0.005、0.007、0.009、0.011、0.013、0.015 g MSNs 于1.5 mL 离心管中，加入1 mL、1.0 mg/mL 的PC 溶液。对该体系进行变温交替处理3 次后，参考（1）方法测定负载率。

（3）变温交替次数对负载率的影响

分别称取0.005 g MSNs 于1.5 mL 离心管中，加入1 mL、为1.0 mg/mL 的PC 溶液。分别对该体系进行变温交替处理1、2、3、4、5 次后，参考（1）方法测定负载率。

1.3.6 响应面法优化MSNs 负载板栗壳PC 工艺

通过上述单因素试验，选取PC 浓度、MSNs 添加量以及变温交替次数这3 个因素，采用试验设计软件Design-Expert（Version 8.0.6），以PC 负载率为响应值，设计3 因素3 水平响应面优化试验，因素水平编码见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Coding table of factor are level

2 结果与分析

2.1 MSNs 显微结构分析

气溶胶法制备的MSNs 颗粒的TEM图见图1，结果显示MSNs 颗粒大小均一，直径大小约为300 nm，颗粒壁厚大约20 nm，中间有明显介孔。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 PC 浓度对负载率的影响

采用1.3.2（2）方法测定出板栗壳提取物中PC 含量为2.58%±0.06%。PC 浓度对负载率的影响见图2。由图2 可知，在低浓度时，负载率随PC 浓度的增高呈现先增高后曲折下降的趋势，当PC 浓度为0.2 mg/mL 时，负载率达到最大值，为13.75%。

2.2.2 MSNs 添加量对负载率的影响

MSNs 添加量对负载率的影响见图3。由图3 可知，PC 负载率随MSNs 添加量的增加而增加，当MSNs 添加量为0.005 g 时，PC 负载率最高，为13.6%。

2.2.3 变温交替次数对负载率的影响

变温交替次数对负载率的影响见图4。由图4 可知，负载率与变温交替次数无明显的线性关系，不同条件下所对应的负载率不同，在第3 组条件（变温交替3 次）时，PC 负载率最高，为12.33%。

2.3 响应面试验分析

2.3.1 响应面分析方案与响应值

分别固定PC 溶液浓度、MSNs 添加量和变温交替次数三个因素的变化对PC 负载率的影响，将这三个因素设为变量，以PC 负载率为响应值，利用BBD 响应面原理设计试验方案，进行负载率条件的优化，响应面分析方案与响应值见表2。

2.3.2 回归模型的方差分析

在回归方程中，二次项系数为负，表明方程具有开口向下的抛物面，在对应因素的所选水平范围内有极大值点，可以进行最优分析。

表2 响应面试验设计方案与响应值Table 2 Design plan and response value of response surface test

根据各项的回归系数，以此建立PC 负载率与A、B、C 三个因素的二次因素回归模型：PC 负载率/%=15.78+0.82A-0.67B-0.17C-1.28AB+0.14AC+0.28BC-4.29A2-1.3B2-1.7C2。从回归模型的方差分析可知，在模型中F值是35.47，这说明模型有显著性。从P<0.000 5 可知，模型是极显著。方程的拟合度用模型的校正系数R2来表示，越高的R2值代表越好的方程拟合度。试验的精确度用离散系数CV值来表示，越低的CV 值代表越高的试验可靠性。该试验的R2=0.978 5，CV=4.97%，这说明该模型能说明97.85%的试验方程的拟合度。从表3（见下页）可以看出，模型的一次项影响是A 极显著，C 不显著。从F值可以看出，单因素对负载率的影响顺序是A＞B＞C，也就是PC 浓度>MSNs 添加量>变温交替次数。交互项BC、AC 不显著，BC 显著。二次项均为极显著。故可以得出选取的各影响因素是合理的，由此可知，这个模型可靠性较高。

2.3.3 响应面交互作用分析

根据回归模型，将任一因素固定在零水平，可以得到体现另外2 个因素及交互作用影响的响应曲面图如图5所示。

由图5（A）可以看出，随着变温交替次数和PC 浓度的增加，PC 负载率呈先增大后减小的趋势，在响应面中心处时出现PC 负载率最大值。在图5（B）中，随着变温交替次数和MSNs 质量的增加，PC 负载率呈先增大后减小的趋势，在响应面中心处时出现PC 负载率最大值。在图5（C）中，随着PC 浓度和MSNs 质量的增加，PC 负载率呈先增大后减小的趋势，在响应面中心处时达到PC 负载率最大值。

通过Design-Expert 响应面分析软件进一步对试验数据进行分析，筛选出3 个因素所选的水平范围内的最佳PC 的负载率。得到最优工艺条件，即PC 浓度0.21 mg/mL、MSNs 添加量0.004 g、变温交替2.93 次。响应面模型预测在这个条件下PC 的负载率是15.96%。考虑实际情况，对此进行修正后，确定最优的负载工艺是PC 浓度0.3 mg/mL、MSNs 添加量为0.005 g、变温交替3 次。

3 结论

以响应面法优化MSNs 负载板栗壳PC 工艺，拟合了PC 浓度、MSNs 添加量以及变温交替次数三个因素对负载率影响的回归方程，分析认为各因素对负载率的影响大小顺序为PC 浓度＞MSNs 添加量＞变温交替次数。最佳工艺参数为PC 浓度0.3 mg/mL、MSNs 添加量0.005 g、变温交替3 次，在此条件下PC 的负载率为15.96%，其R2=0.978 5，说明该试验优化得到的技术参数是可靠的。试验得到的最佳PC-MSNs 复合体能为今后提高PC 生物利用率和在体内可控释放研究提供参考依据。