玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒香气物质组成及酿酒酵母对其的影响

徐晴芳，王华艳，陆开祥，苏海泽，蔡建

（曲靖师范学院，云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南曲靖 655011）

玫瑰蜜葡萄是云南高原产区具有代表性的葡萄品种[1]，该品种属于欧亚种与美洲种的杂交品种（Vitis vinifera×V.labrusca）[2]，在云南地区主要用于鲜食和酿造葡萄酒，广泛种植于红河州的弥勒以及迪庆州的香格里拉河谷地区。玫瑰蜜是云南高原葡萄酒产区主要的红色酿酒品种之一，在弥勒地区已有数十年的栽培历史，加工酒种主要为干红、桃红和蒸馏型葡萄酒[3-4]。玫瑰蜜葡萄酿造的葡萄酒风味特征鲜明，酒色一般呈宝石红，具有美洲种典型的浓郁气息[2]，并伴随花香、蜜香和草莓、樱桃等红色浆果香。近年来，也有研究者探索将该品种用于贵腐葡萄酒的酿造[5]，并对其香气成分组成进行了定性分析。但总体而言，玫瑰蜜进行特色果酒新产品开发和产品香气物质组成的相关研究还较少。

云南高原低纬度、高海拔以及复杂多样的小气候类型和土壤构成，使得玫瑰蜜葡萄在云南产区形成了独特的风味品质特性，具备了优质特色果酒产品的开发潜力。本研究在玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒新产品开发的基础上，分析了该酒种的香气物质组成，并初步探究了其与酒精发酵所采用酵母类型的关系，为后续产品香气品质提升的工艺参数优化研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四种商业化酵母：CEC01（安琪酵母）、VIC（安琪酵母）、S101（法国Fermentis）、ADT（安琪酵母）。

葡萄糖、无水乙醇、酒石酸钾钠、氢氧化钠、次甲基蓝，均购于天津市风船化学试剂科学有限公司；浓盐酸，购于成都市科隆化学品有限公司；酚酞，购于天津市化学试剂一厂；氯化钠，购于ANPEL 实验室技术（上海）有限公司。

香气物质检测标样共107 种，均为色谱纯，购于Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

CP214 电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；DHG-9245A 电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；XMTD-204 数显恒温水浴锅，上海双捷实验设备有限公司；雷磁pHS-3CpH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；电子万用炉，北京市光明医疗仪器有限公司；附温比重瓶，海门市测温仪器厂；酒精温度计、比重计、酒精计，国营武强仪表厂；手持糖度折光仪，上海淋誉贸易有限公司；TGL-16M医用离心机，湘仪离心机仪器有限公司。气相色谱为美国Agilent 7890 GC，配备CTC 三合一全自动HS-SPME 自动进样器；质谱为美国Agilent 5975 B 四级杆质谱仪。

1.3 葡萄原料及葡萄酒酿造

玫瑰蜜葡萄采摘于云南弥勒东风农场，该农场葡萄园海拔1 350 m，树龄15 年，树体架式为棚架式，株行距为2 m×3 m，园内土壤为红壤土，采收期为2018 年7 月15 日，采收时可溶性固形物含量为16～17 °Brix。葡萄采收后立即用容量为20 kg 塑料筐运至曲靖师范学院果酒中试车间进行加工，原料总质量为5 t。

葡萄原料除梗破碎后立即添加30 mg/L SO2，采用螺杆泵泵入两个2 m3容积不锈钢发酵罐中浸渍24 h 后将葡萄汁（呈桃红色）抽出混匀，然后分别倒入12 个100 L不锈钢控温发酵罐中，接入四种商业化酵母进行控温发酵（每一酵母进行3 个发酵罐重复），发酵温度控制在15～17 ℃，发酵过程中每隔4 h 监控温度、比重并记录。当发酵比重降低26 个点后将发酵温度迅速降至-2 ℃中止发酵，并加入100 mg/L SO2。待酵母沉淀后采用0.45 μm 聚醚砜膜进行除菌过滤，每一发酵罐酒样过滤后立即装入4 个300 mL 塑料瓶，其中两瓶立即用于理化指标测定，另两瓶于-25 ℃冰箱冻藏待测香气物质。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 理化指标检测

葡萄汁、葡萄酒理化指标（糖、酸、pH、酒精度、挥发酸）的测定均参照国标《GB/T15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》[6]中的方法进行，所有指标均测定3次，取平均值。其中总糖、还原糖按葡萄糖计，滴定酸按酒石酸计。

1.4.2 香气物质HS-SPME-GC-MS 检测条件

（1）顶空固相微萃取

样品前处理采用顶空固相微萃取（HS-SPME）法在CTC 自动进样器中进行。取5 mL 经6 000 r/min 离心10 min 后的葡萄酒样品上清液置于20 mL 顶空瓶中，同时加入1 g 氯化钠、20 μL 1 g/L 的4-甲基-2-戊醇内标，旋盖后40 ℃平衡30 min，将DVB/CAR/PDMS 涂层的SPME 萃取头插入顶空瓶在40 ℃下吸附30 min。

（2）气相色谱条件

气相色谱柱为美国J&W 公司HP-INNOWAX 毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温条件为50 ℃持续1 min，以3 ℃/min 的速率升至220 ℃，保留5 min，再以10℃/min 升至230℃，保留2min。进样口温度250℃，载气为高纯氦，流速1 mL/min。

（3）质谱条件

质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，EI电离源电子能量70 eV，扫描界限在45～300 u。

1.4.3 香气物质的定性与定量

化合物的定性采用AMDIS 软件结合已建立的葡萄酒香气物质检索谱库对GC-MS 全扫描数据文件进行解卷积分析[7]。在定性过程中，根据各物质的保留时间计算相应的保留指数（RI）。将该组分的RI 同标样RI、质谱谱图及NIST Chemical WebBook 中收录的wax 类型极性柱条件下测得的RI 比较，差值绝对值小于50 的组分可定性为该化合物。化合物定量方法与之前的研究方法相同[8]，即对于已有标样的物质，利用其对应的标准曲线进行定量；对没有标样的物质利用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标样香气物质的标准曲线进行近似定量。所有样品在定量分析中均重复测定3 次。

1.5 数据处理与分析

方差分析和主成分分析（PCA） 均在IBM SPSS Statistics（Version 19）中进行。

2 结果与分析

2.1 理化指标

发酵前葡萄汁和4 种酵母发酵后低醇桃红葡萄酒的理化指标见表1。由表可知，玫瑰蜜葡萄果实在正常成熟后具有较高的酸度和较低的pH 值。在酿造葡萄酒时，高酸度可能导致口感不均衡，因此在酒种设计上该品种更适合甜型葡萄酒的酿造。从发酵后桃红葡萄酒的酸度和pH 值来看，依然保留了较高的酸度和较低的pH 值。黄露莉等[5]在研究玫瑰蜜人工贵腐酒的结果中得出，经过灰霉菌浸染和对照处理的玫瑰蜜果实酿造的葡萄酒，其滴定酸含量仍然较高，分别为7.5 g/L 和8.5 g/L，pH 值为3.5 和3.3。玫瑰蜜果实的高酸度需要酿酒师在酿造时高度重视，以免导致产品口感失衡。

从四种酵母发酵后葡萄酒的酒精度和残糖量来看，四种酵母对糖的转化率存在差异。CEC01 酵母发酵后酒精度和残糖均高于其它三种酵母，说明该酵母将糖转化为酒精的得率较高。从保留糖度的角度看，该酵母比较适合用于玫瑰蜜甜型桃红葡萄酒的发酵。因为该葡萄品种在云南弥勒地区自然成熟时糖度并不高，酵母较高的酒精转化率可使产品在相同酒精度下保留更高的糖分，以平衡原料的高酸度。此外，S101 酵母发酵后葡萄酒中滴定酸含量显著低于其它三种酵母，从降酸的角度看，这一酵母具有明显的效果，可在其它种类高酸水果原料中进一步研究评估其对不同产品风味的整体影响。

表1 不同酵母发酵玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒理化指标Table 1 Physicochemical parameters of the juice and wine samples

2.2 玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒的香气物质组成

在四种商业酵母发酵的玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒中共检测到128 种挥发性风味成分，其中107 种物质采用标样进行定性定量，其余21 种无标样的物质采用保留指数（RI）和NIST 谱库比对进行定性，采用结构类似物标线进行近似定量。黄露莉等[5]同样采用HS-SPME-GC-MS 技术研究了人工接种灰霉菌对玫瑰蜜葡萄酒香气的影响，但由于未采用香气物质标准品进行定性定量，鉴定出的物质种类相对较少，在对照和人工贵腐酒种分别鉴定出29 种和42 种挥发性成分。调查显示，本研究是首次较为全面地对玫瑰蜜葡萄酒香气物质进行定性定量分析，这为该品种葡萄酒香气品质形成机制的研究奠定了基础。

从检测到的挥发性风味组分种类而言，该品种葡萄酒香气物质组成丰富，包含了从高级醇（17 种）、酯类（62 种）、脂肪酸（5 种）、醛酮（7 种）等酵母代谢产物[9-10]到萜烯（21 种）、降异戊二烯（2 种）、挥发性酚（3 种）、含氮化合物（3 种）等各类品种香气组份[11]。尤其是酯类物质和萜烯类物质，是玫瑰蜜桃红葡萄酒中所有物质组成种类中最丰富的两类，其中酯类物质种类占所有检出物质种类的47.7%，萜烯类物质种类占16.4%。酯类物质和萜烯类物质分别是葡萄酒果香和花香的主要物质基础[9-11]，丰富的酯类物质和萜烯类物质组成从物质基础上很好地解释了玫瑰蜜桃红葡萄酒具有浓郁的水果香气和花香、蜜香的原因。

2.2.1 高级醇

高级醇是酵母酒精发酵过程中产生的一类重要的次生代谢物，葡萄汁中的氨基酸组成对发酵后高级醇的组成有重要的影响[9]。高级醇也通常被称为杂醇油，由于这类物质大部分具有较强烈的刺激性不良气味（β-苯乙醇除外），对蒸馏酒和发酵酒的风味都有较强的影响。在葡萄酒中，当高级醇浓度较低时（<300 mg/L），这些不良气味的高级醇对酒的香气具有促进作用，可以增加葡萄酒香气的复杂性；而当其浓度较高时（＞400 mg/L），则会给酒的香气带来负面影响，导致酒的香气粗糙，缺乏优雅[12]。

在四种酵母发酵的玫瑰蜜桃红葡萄酒中，高级醇的总量为640～740 mg/L，其中含量最高的为异戊醇和β-苯乙醇，其含量范围分别为260～350 mg/L 和190～250 mg/L。β-苯乙醇具有宜人的玫瑰花香气，在模拟酒溶液中的阈值为14 mg/L[13]，在所有四个葡萄酒样品中，β-苯乙醇的含量均高于其阈值10 倍以上，因此该物质对玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒浓郁的花香起到了重要的贡献作用。除去β-苯乙醇后不良气味高级醇的含量在四个样品中均不高于400 mg/L，因此可以推测这类物质给玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒香气带来的负面影响并不明显。

2.2.2 酯类物质

酯类物质是发酵型果酒香气的重要组成物质，葡萄酒及其它果酒中的果香大部分是由酯类物质产生[10]。虽然很多水果本身的果实香气是由各种酯类物质形成，但其含量很有限，葡萄酒和果酒中的果香主要还是由酵母发酵过程中次生代谢形成[10,12]。这些酯类物质根据结构和在酵母中的合成途径不同主要可以分为两大类：一类是由乙酰辅酶A 和氨基酸降解产物所形成的乙酸高级醇酯（乙酸酯），另一类是由脂肪酸代谢过程中产生的脂酰辅酶A 醇解所形成的脂肪酸乙酯或脂肪酸高级醇酯。乙酸酯和大部分中短链脂肪酸乙酯的香气阈值都较低，对葡萄酒尤其是白葡萄酒和桃红葡萄酒香气起着重要的贡献作用[14-15]。

在本研究四个酵母发酵的玫瑰蜜桃红葡萄酒中，检测到的酯类物质种类是所有物质种类中最丰富的，每一样品中均检测到了61 种酯类物质，其中乙酸酯12 种、脂肪酸乙酯31 种，脂肪酸高级醇酯18 种。丰富的酯类物质组成，很好地解释了玫瑰蜜桃红葡萄酒具有浓郁水果香气的原因。

在乙酸酯中，含量较高的是乙酸异戊酯、乙酸丙酯、乙酸苯乙酯和乙酸己酯，其含量范围分别为17～29、1～2、9～12、2～4 mg/L。乙酸异戊酯具有典型浓郁的香蕉气味，其香气阈值为160 μg/L；乙酸苯乙酯具有宜人的果香和玫瑰花香，其香气阈值为1.8 mg/L；乙酸己酯具有典型的苹果和梨的香气，其香气阈值为1.5 mg/L[8]。在玫瑰蜜桃红葡萄酒中，这三种乙酸酯的含量均超过了其阈值，是产品香气的重要组成物质。尤其是乙酸异戊酯，其含量范围达到了其阈值的100 余倍。值得一提的是，S101 酵母产乙酸异戊酯的能力远高于其它三种酵母，其产生的乙酸酯总量也最高。

在检测出的31 种脂肪酸乙酯中，含量较高的为乳酸乙酯（奶油味和果香，155 mg/L）、癸酸乙酯（果香，阈值0.2 mg/L）、辛酸乙酯（香蕉和梨的香甜气味，阈值0.58 mg/L）、丁酸乙酯（香蕉、菠萝、草莓香气，阈值0.4 mg/L）和苯乙酸乙酯，其含量均超过了mg/L 量级，其中含量最高的分别为癸酸乙酯、乳酸乙酯和辛酸乙酯。乳酸乙酯由于香气阈值较高，其对样品葡萄酒香气的直接贡献有限。其它几种高含量的脂肪酸乙酯其含量均超过其阈值，对玫瑰蜜桃红葡萄酒果香的形成起到了重要的贡献作用，尤其是癸酸乙酯、辛酸乙酯和丁酸乙酯。

2.2.3 萜烯及降异戊二烯类物质

葡萄酒中的萜烯和降异戊二烯类物质主要来源于葡萄原料，是葡萄酒品种香的重要组成物质。这两类物质主要呈现宜人的花香和果香，由于其香气阈值较低，因此对葡萄酒的花果香气具有直接的贡献作用，同时也会通过协同作用共同提升葡萄酒的香气[12]。

在样品葡萄酒中共检测出21 种萜烯和2 种降异戊二烯，检测出的物质种类仅次于酯类物质，是玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒的另一类重要香气物质。其中含量较高的分别为α-萜品油烯、4-萜烯醇、α-萜品醇、香茅醇、香叶醇和β-大马士酮。顺式-玫瑰醚（荔枝香味）虽然含量较低，但由于其香气阈值仅为0.2 μg/L，在4 种酵母发酵样品中的含量均超过了其阈值，也是玫瑰蜜桃红葡萄酒重要的香气组分。虽然其它大部分萜烯含量并未超过其香气阈值，但种类丰富的萜烯共存会通过协同作用共同对样品葡萄酒香气起积极作用，提高葡萄酒香气的复杂性。β-大马士酮具有优雅的花香和成熟的苹果香，由于其香气阈值极低（0.14 μg/L），是葡萄酒香气的重要组成物质。在检测的葡萄酒样品中，其含量范围为17～56 μg/L，远远超过其香气阈值，该物质也是玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒香气的重要呈香物质。

2.2.4 邻氨基苯甲酸酯

邻氨基苯甲酸酯是美洲种葡萄果实的特征香气物质，其气味浓郁（香气阈值3 μg/L），具有典型香甜的草莓、柑橘类水果的香气，是著名的美洲种康可葡萄（Concord）特有的“狐臭味”（“foxy”）的重要呈香物质[16]。四种酵母发酵的玫瑰蜜桃红葡萄酒中均检测出了两种该类物质，分别为邻氨基苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸乙酯，其含量范围分别为22～31 μg/L 和1～3 μg/L。由其含量和香气阈值可以看出，与美洲种葡萄类似，邻氨基苯甲酸甲酯也是玫瑰蜜葡萄酒品种香重要的特征组分。该种物质的大量存在也进一步证明了玫瑰蜜与美洲种葡萄之间的亲缘关系。最近一项关于鲜食葡萄果实香气物质组成的研究中也发现，具有“狐臭味”的欧美杂种都含有这种物质[17]。

此外，在玫瑰蜜桃红中还检测出另一种含氮化合物苯乙腈（Benzyl nitrile，CAS 号140-29-4），在我们以往检测的葡萄酒和其它果酒样品中均未检测到过该物质。大多数的腈类物质具有较高的毒性，天然存在于土壤、植物和微生物中，也可以通过人工合成应用于工业生产[18]。最近的研究发现，该物质是玛咖挥发油的主要组成物质[19-20]，在乌龙茶中也存在[21]。该物质在发酵前的玫瑰蜜葡萄汁中也同样可以检测到（数据尚未发表），推测其主要来源于葡萄原料自身，其在玫瑰蜜葡萄和葡萄酒中的形成演化机制有待进一步研究。

2.2.5 其它重要成分

除以上香气物质外，玫瑰蜜桃红葡萄酒中还有一些呈香物质，如苯乙醛、甲硫醇。苯乙醛具有浓烈的花香和蜜香，在模拟酒溶液中的香气阈值非常低，仅为1μg/L[14]。在本研究样品中，苯乙醛的含量范围为620～800 μg/L，高出其阈值数百倍，是玫瑰蜜桃红葡萄酒花蜜香的重要呈香物质。甲硫醇具有卷心菜、煮土豆和大蒜味，含量过高对葡萄酒的香气会造成负面影响。该物质在模拟酒溶液中的香气阈值为1 mg/L[14]。在四种酵母发酵的葡萄酒样品中，该物质的浓度范围为1～5 mg/L，均达到或超过了其阈值，很显然在浓度较高的样品中会对葡萄酒香气造成不良影响。

2.3 酿酒酵母对香气物质组成的影响

将检测出的各物质在4 种酵母发酵样品中含量平均值的最大值与最小值相除，将所得比值大于1.5 的物质含量进行主成分分析（PCA）。PCA 分析的样品包括4 种酵母，其中每种酵母包括3 个发酵罐，总计12 个样品。

经过PCA 分析（见下页图1），前两个主成分解释的总方差累计为71.4%，其中PC1 为47.2%，PC2 为24.2%。由各样品在PC1 与PC2 中的得分散点图和物质载荷图可以看出（图1），4 种商业酵母在不同发酵罐中发酵样品的香气物质组成可通过PCA 分析进行区分，每一类型酵母发酵葡萄酒样品均可聚为一类，说明酵母类型对玫瑰蜜桃红葡萄酒香气物质组成具有明显的影响。通过得分图和载荷图的比对可以看出，四种酵母发酵后葡萄酒香气物质组成各有特点，其中ADT 酵母发酵后呈现花香的萜烯、降异戊二烯、苯乙醛、苯乙醇等类物质含量均较高，丙醇及脂肪酸丙酯含量也较高；S101 酵母发酵后样品中的甲硫醇和果香类物质乙酸异戊酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯含量较高；VIC 酵母发酵后样品中乙酸、乙醛和乙偶姻含量较高；CEC01 酵母发酵后样品中乙酸乙酯、9-癸烯酸乙酯和二氢肉桂酸乙酯含量较高。因此，采用ADT 酵母发酵玫瑰蜜桃红葡萄酒更利于产品花香的形成，采用S101 酵母发酵更有利于产品果香的形成，在实际生产过程中可以考虑采用这两种酵母混合发酵或发酵后调配的方式来提升产品香气的综合品质。

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS 对四种商业酵母发酵的玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒香气物质组成进行了定性定量分析，研究结果表明玫瑰蜜桃红葡萄酒香气物质组成种类丰富，其中酯类和萜烯类物质种类最多，关键呈香物质包括邻氨基苯甲酸甲酯、β-苯乙醇、苯乙醛、β-大马士酮、顺式-玫瑰醚、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯等。同时，玫瑰蜜低醇桃红葡萄酒香气物质组成也受到酵母类型的显著影响，其中ADT 酵母发酵可产生较多的花香类物质，S101 酵母发酵可产生较多的果香类物质。