亚硒酸钠的多器官保护作用及其抗新型冠状病毒的组学预测

刘格良，张皓旻，王毅兴，迟小华，陈浩然，陈熙勐，张钧栋，李卓阳，智 鹏,，杨 波，叶 芳，卢学春*

0 引言

2019年12月开始，中国湖北省武汉市开始陆续出现多例不明原因的肺炎患者，感染者最常见的临床症状表现为发烧、咳嗽、头疼、肌肉酸痛等，重症和危重症患者可出现急性呼吸窘迫综合征、造血系统抑制、急性肾损伤和急性心脏损伤等多器官损伤，胸部影像学显示双肺浸润性炎症改变[1-2]。经中国有关部门确认，这是一种由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的传染性疾病[3]。根据一系列临床研究发现，尽管COVID-19总体病死率较严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)低，但患者一旦发展为重症或危重症，短期内病情进展迅速，往往累及两个或两个以上的器官损伤，最终多器官衰竭导致死亡。然而遗憾的是，现阶段临床针对COVID-19的治疗策略以器官功能支持和预防并发症为主，缺乏特异性抗病毒药物，仅有部分患者能够获益，对于重症危重症患者缺乏有效治疗措施。而在以往研究中，已证实亚硒酸钠不仅是有效的病毒抑制剂[4-5]，还具有调节人体免疫平衡，抗炎症和多器官保护的作用[6]，猜测其针对COVID-19可能具有潜在的治疗作用。因此，本课题组通过分析亚硒酸钠对全基因组表达谱的影响，结合表观精准治疗预测平台(EpiMed)的预测结果，探索亚硒酸钠多器官保护作用及其针对COVID-19的潜在治疗作用。

1 资料和方法

1.1 数据来源 本研究数据来源于GEO数据库，该数据库提供了大量可供研究人员免费获取的基因表达数据[7]。以“Sodium selenite”为关键词进行检索，以全基因组表达芯片数据或转录组测序数据、有对照组、每组至少3个生物学重复以及实验设计思路清晰为标准筛选数据。

1.2 实验设计 本研究所使用的数据集均为经过GEO数据库预处理后的转录组表达谱矩阵。根据数据来源实验描述以及各样本类型，将数据类型设定为对照组与实验组，即：连续1 d、3 d和5 d向大鼠经口服填喂2 mg/kg亚硒酸钠的实验组与连续1 d、3 d和5 d向大鼠经口服填喂水的对照组。进行差异分析并进行后续的分析研究。

1.3 方法

1.3.1 数据预处理、标准化与差异表达基因的筛选 在Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)网站下载生物信息分析的R语言程序包[8]。利用Bioconductor中的Impute程序包KNN算法补全表达谱缺失值[9]。同时利用Bioconductor中的GEOquery程序包下载与实验数据集相匹配的平台注释文件GPL5425[10]，并使用R语言编写代码将探针对应到基因上。如果多个探针对应一个基因，则采用所有探针表达值的平均值代表这个基因的表达值。得到两组数据集的表达谱用于后续分析。随后利用Bioconductor中的Limma程序包筛选差异表达基因。首先使用P<0.05初步筛选差异表达基因，随后利用Bonferroni算法矫正假发现率(FDR)的原始P值并计算倍数变化(FC)[11]。本研究中，差异表达基因的筛选标准为FDR<0.05，|Log2FC|>1。差异结果保存用于后续分析。

1.3.2 筛选显著性基因与人类同源基因转换 利用上述分析得到的差异表达基因，采用R语言中的RRA算法筛选差异表达基因中的显著性基因。RRA方法主要是对不同数据集获得的基因进行排序。如果1个基因在所有实验中表达倍数越高，且P值越小，则其越显著[12]。

筛选得到显著性基因后，利用Bioconductor中的biomaRt程序包[13]，分别获取人与大鼠的注释信息，并进行人类同源基因转换。

1.3.3 构建显著性差异表达基因的蛋白质相互作用调控网络 利用STRING v11.0(https://string-db.org/)开源数据库构建蛋白质互作(Protein-protein interaction,PPI)网络[14]。为了更好地理解重要基因的相互作用，使用STRING数据库预测其编码蛋白PPI网络，本研究使用的可靠性阈值为>0.4。Cytoscape软件(https://cytoscape.org/)用于构建PPI网络，每个节点代表基因、蛋白质或其他分子，节点之间的连线代表生物分子之间的相互作用[15]。PPI网络可用于识别亚硒酸钠调控的显著基因编码的蛋白质之间的相互作用和通路关系。核心节点，即具有重要生物功能的蛋白质通过计算蛋白质之间的连线数以及每个节点与特定节点有无直接连接来确定，并给出排名。本研究使用Cytoscape软件中的CytoHubba插件筛选核心节点，结果输出前10名基因[16]。

1.3.4 富集分析 利用Bioconductor中的ClusterProfiler程序包[17]进行基因本体学(GO)[18]和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集[19]分析。本研究对出现在PPI网络中的显著性差异表达基因进行聚类，聚类结果以P<0.05为阈值进行筛选，最后利用R语言对结果进行可视化展示。

1.3.5 疾病关联分析与药物关联分析 本研究团队前期基于“系统生物学”和“比较功能基因组学”理论设计了“整合多组学分析”算法，并以此为基础建立了涵盖所有疾病、中药、化合物的人体功能基因组学数据的表观精准治疗预测平台(Epigenomic Precision Medicine Prediction Platform，EpiMed)[20-23]。疾病关联分析则是利用EpiMed对亚硒酸钠进行多组学疾病关联分析，以关联强度<-0.1且P<0.05为阈值，筛选亚硒酸钠可能具有潜在治疗作用的疾病与相应的分子治疗靶点。药物关联分析则是以关联强度的绝对值>0.1且P<0.05为阈值，筛选可能与亚硒酸钠具有相似治疗作用或不良药物相互作用的药物。

2 结果

2.1 数据来源 在GEO数据库以“Sodium selenite”为关键词进行检索，共得到205条Series，经过逐一筛选，发现GSE59913数据集内不仅含有正常大鼠在亚硒酸钠影响下的全基因组表达谱数据，并且设置有相应的对照组，能满足本课题的研究需求。本研究使用的数据具体样本描述见表1。

表1 数据具体样本基本描述

2.2 差异表达基因分析 用药1 d、3 d、5 d的3组数据分别筛选出差异表达基因288、152、186个。其中上调表达的基因分别为162、81、95个，下调表达的基因分别为126、71、91个(图1A、图1B、图1C)。利用RRA算法对两组差异结果综合统计得到376个显著性基因，其中178个基因表达上调，198个基因表达下调，部分显著性基因结果见图1D。利用R语言进行人类同源基因转换，最终获得人类同源基因273个。

图1 差异表达基因分析与样本显著性基因注：A：用药1 d的差异表达基因；B：用药3 d的差异表达基因；C：用药5 d的差异表达基因；D：RRA算法筛选的部分显著性基因结果。FDR<0.05，|Log2FC|>1

2.3 显著性基因蛋白质相互作用调控网络构建 用STRING开源数据库对显著性基因进行PPI网络构建，其中有221个蛋白出现在PPI网络中，显示出与其他蛋白的相互作用关系(图2A)。依据基因连线数目筛选核心基因(hub gene)，统计结果图形化展示见图2B。

图2 蛋白质相互作用网络与关键基因注：A.蛋白质相互作用网络；B.利用MCC插件根据蛋白质相互作用网络的拓扑结构筛选出的关键基因

2.4 蛋白质互作网络中出现的显著性基因的富集分析 对273个显著性基因进行富集分析，GO分析结果显示，这些基因的富集情况分为生物学进程、细胞成分、分子功能3种类型(图3)。其中，在生物学进程方面，这些基因大多与血管生成、激素分泌与运输、氧化应激反应、细胞凋亡信号有关。在细胞成分方面，大多影响细胞质的功能。在分子功能方面，大多与氧化还原酶活性、转运酶活性、血红素活动有关。

图3 基因本体(GO)富集结果注：横坐标为GO ID编号，纵坐标表示每个GO中被富集的基因数量

KEGG通路富集分析显示，273个显著性基因多富集在免疫反应、细胞生命周期调节、心功能调节、造血功能调节、病毒感染性疾病相关通路(图4)，其中C8B、C9、EGR1、IL1β、NCAM1等基因主要富集在朊病毒病相关信号通路(图5A)；CSNK1d、PRKAA1、ARNTL等基因主要富集在心脏功能调节相关信号通路(图5B)；AKR1B10、GGH、GPHN等基因主要富集在叶酸生物合成信号通路(图5C)；CDK2、PCK1、PRKAA1、SMAD4、CDKN2B、EGFR、GRM1、MAPK9等基因主要富集在FoxO信号通路(图5D)；D3D、IL5、DLL3、FOS、PPP3CA、ATF2、CCL2、IL1β、MAPK9、SELE等基因主要富集在免疫调节相关通路(图5E)。

图4 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集结果注：横坐标表示每个通路中富集的基因数量，纵坐标表示通路名称，P<0.05

图5 京都基因与基因组百科全书通路图展示注：A.朊病毒病信号通路；B.昼夜节律信号通路；C.叶酸生物合成信号通路；D.叉头框信号通路；E.免疫调节相关信号通路

2.5 疾病关联分析与药物关联分析 利用EpiMed进行多组学疾病关联分析，本研究发现，亚硒酸钠可能通过相应分子治疗靶点针对多发性退行性关节炎、流行性感冒、社区获得性肺炎、呼吸道合胞体病毒感染、SARS等疾病具有潜在治疗作用，见表2。在药物关联分析方面，本研究发现，亚硒酸钠与奈韦拉平、西多福韦、虎杖、白头翁等药物呈正相关，提示亚硒酸钠可能与这些药物联用具有协同作用(表3)；而与索拉非尼、卡那霉素、景天等药物呈负相关，则提示与这些药物的不良相互作用(表4)。

表2 亚硒酸钠可能具有潜在治疗作用的部分疾病及相应的分子治疗靶点

表3 EpiMed平台关于亚硒酸钠的药物关联分析预测结果(正相关)

表4 EpiMed平台关于亚硒酸钠的药物关联分析预测结果(负相关)

3 讨论

COVID-19是一种新发传染病，病原为SARS-CoV-2，人群普遍易感。已有研究证实，SARS-CoV-2属β冠状病毒，与SARS-CoV核苷酸同源性高达85%，且其体内结合蛋白与SARS-CoV相同，均为血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)。综合现有研究发现，COVID-19重症患者最常同时受累的器官和系统包括：肺、心脏、消化道、肾脏、肝脏、中枢神经系统和造血系统，临床救治难度极大，死亡率高达61.5%[24]。通过THE HUMAN PROTEIN ATLAS(https://www.proteinatlas.org/)查询发现，ACE2在上述多个人体器官组织中均表达丰富，且已有大量相关研究证实[24-27]。除此之外，通过对COVID-19患者尸检发现，患者的肺组织除了有免疫细胞浸润外，还存在肺细胞脱落和肺透明膜形成。肺泡腔内存在多核合胞细胞，表现出病毒性细胞病变[28]。并且日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)等RNA病毒直接导致细胞凋亡在Mukherjee等[29]的研究中已被证实。据此推测，ACE2作为SARS-CoV-2进入人体细胞的特异性受体，在全身多个组织器官表达丰富，重症患者由于病毒载量高，SARS-Cov-2在全身多个器官激活凋亡信号通路，人体内多脏器受损更加显著，最终致使患者多脏器功能衰竭死亡[30]，且成昊等[31]研究同样认为SARS-CoV-2感染靶器官的关键点在于ACE2在人体的分布和表达情况，进而从肾素-血管紧张素系统角度讨论了COVID-19患者的多器官保护治疗策略。因此，我们认为，针对COVID-19患者，不仅要进行充分有效的抗病毒、抗炎症治疗，还应注重人体多脏器的保护，尽量减少和避免患者向重症、危重症发展。尽管磷酸氯喹、阿比多尔、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦、利巴韦林、干扰素等药物目前已在临床上试用，但其疗效有待于更大规模的临床试验进一步证实。

亚硒酸钠是目前应用最普遍的硒强化剂，具有抗肿瘤、抗炎症、调节细胞生命周期的作用[32]。在以往研究中证实亚硒酸钠能够抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、埃博拉病毒(Ebola virus)的转录和复制，从而有效起到抗病毒的作用[33]。除此之外，Reinhart等[34]研究发现，患者血浆内硒的含量与组织的损伤、感染和多器官功能衰竭高度相关。并且已有研究证实，亚硒酸钠对肝脏、肾脏、睾丸、心脏以及造血系统等人体多组织器官具有保护作用。

本研究旨在通过分析亚硒酸钠对全基因组表达谱的影响，结合表观精准治疗平台(EpiMed)分析结果，探索其多器官保护作用以及对COVID-19潜在治疗作用机制。研究发现，亚硒酸钠对人体全基因组影响复杂，进一步的蛋白质相互作用网络显示，EGFR、FOS、CCL2、IL-1β、CXCL12、MMP2、ADRB2、SMAD4、JAK2、PPARA这10个关键基因在网络中具有重要地位。Yi等[35]研究已证实，CCL2、IL-1β作为促炎细胞因子参与呼吸道炎症。Gandhi等[36]研究指出，MicroRNA-141可以下调PPARA表达来降低HBV启动子活性，从而抑制病毒复制。其余关键基因大多也与免疫调节、细胞周期调控、炎症反应相关[37-44]。在本研究中,认为亚硒酸钠治疗COVID-19可能与这些关键基因的调控密不可分。一方面，亚硒酸钠可能通过下调EGFR、CCL2、IL-1β、MMP2、FOS、ADRB2等基因的表达，降低患者血清炎性细胞因子表达水平，抑制病理性血管的生成、免疫细胞的大量增殖以及调控趋化因子浓度梯度，防止大量免疫细胞向肺部的趋化；另一方面亚硒酸钠可能通过上调CXCL12、SMAD4、JAK2、PPARA等基因的表达，降低IL-5、IL-6和IL-13等细胞因子表达水平，阻断特定的上皮细胞对炎症信号的应答，抵抗炎症发生。还可以分泌调节性T细胞，激活下游转录生长因子，在抑制病毒复制的同时，发挥器官保护和修复作用。

在信号通路方面，本研究发现，亚硒酸钠的作用不仅限于抗病毒，如：亚硒酸钠可以抑制硫醇/二硫键交换反应，特别是在蛋白质二硫键异构酶(PDI)催化病毒糖蛋白附着到宿主细胞膜过程中发生的一系列交换反应，从而阻止病毒进入宿主细胞，发挥抗病毒作用[33]；亚硒酸钠还可能激活PI3K/Akt信号通路，不仅可以诱导树突状细胞产生干扰素，还可以抑制巨噬细胞凋亡，从而有效杀死未进入细胞的病毒体，吞噬被病毒感染和凋亡的细胞，有效降低病毒载量[45]。除此之外，推断亚硒酸钠还可以通过调控Th1、Th2及Th17细胞分化通路、TNF信号通路和PPAR信号通路发挥人体免疫调节的作用，降低人体内多种细胞炎症因子水平，起到治疗慢性呼吸道炎症的作用[46]。亚硒酸钠的摄入不仅可以抑制这些促炎通路，控制患者体内细胞因子和趋化因子的表达，降低人体内活性氧类(Reactive oxygen species，ROS)水平，还可以通过激活PPAR信号通路诱导巨噬细胞向有抗炎作用的M2表型分化，从而有效抑制炎症反应[47-48]。

与此同时，亚硒酸钠还可能具有多器官保护作用，如亚硒酸钠调控昼夜节律通路，抑制Bmal1的表达，而Per、Cry分别被Ckk/6和AMPK磷酸化激活，在细胞质中积累，从而稳固心肌细胞生物钟的负反馈环，降低心功能障碍的风险，在以往研究中已被证实[49]。亚硒酸钠还可以激活叶酸生物合成信号通路，加速四氢叶酸(Tetrahydrofolic acid，THF)的合成，以激活后续复杂的酶促反应网络，帮助患者恢复正常造血功能，在以往研究中已被证实[50-51]。此外，武红平等[52]研究发现，FoxO信号通路，下游的抗凋亡蛋白BCL2L1在抵抗流感病毒感染诱导的宿主细胞凋亡方面发挥重要作用。张磊等[53]发现，通过激活FoxO信号通路,可以抑制慢性肾衰竭中的慢性肾间质纤维化和氧化应激反应，起到器官保护作用。据此可以进一步推测，亚硒酸钠可以调控FoxO信号通路介导抗凋亡和抗炎反应，抑制细胞的异常衰老死亡，抵抗病毒诱导的细胞凋亡而导致的器官损伤，发挥多器官保护作用。

在疾病关联方面，利用本课题组前期建立的表观精准治疗预测平台(EpiMed)分析发现，亚硒酸钠针对多发性退行性关节炎、流行性感冒、社区获得性肺炎、SARS、呼吸道合胞体病毒感染等疾病具有潜在治疗作用。值得注意的是，这些疾病的临床病理特征与COVID-19较为相似，且EpiMed预测出的治疗靶点如FOS、CCL2、CXCL12、EGR1、IL-1β、C9、SELE、IL-5等不仅出现在关键基因中，而且还在上述提及的信号通路中发挥重要作用。这间接提示亚硒酸钠可能通过这些分子靶点调控抗病毒、免疫及细胞周期相关通路，调节人体免疫反应，提高免疫耐受，抑制炎症反应，阻止人体多脏器受损，发挥对COVID-19的潜在治疗作用。在药物关联分析方面，奈韦拉平、泛昔洛韦、西多福韦、利巴韦林、氯喹、白头翁、虎杖、冬青等一系列药物与亚硒酸钠呈正相关，提示这些药物可能与亚硒酸钠具有相似的治疗作用。而索拉非尼、拉贝洛尔、卡那霉素、薯蓣、景天等一系列药物与亚硒酸钠呈负相关，提示这些药物可能与亚硒酸钠之间存在不良药物相互作用，联合用药需谨慎，以上推断有待进一步研究证实。

综上所述，本研究通过亚硒酸钠影响下的全基因组进行分析，初步探究了亚硒酸钠作用于人体的分子机制，发现亚硒酸钠可以调控多个分子靶点和信号通路，发挥其调控细胞周期、抗炎症、抗病毒、调节人体全局免疫环境和人体多器官保护的作用。结合表观精准治疗预测平台(EpiMed)的分析结果，从而推测亚硒酸钠可能通过相同机制对COVID-19具有潜在治疗作用，对于亚硒酸钠应用于临床治疗COVID-19具有一定的指导意义。