非小细胞肺癌组织中长链非编码RNA结肠癌相关转录子1的表达及临床意义

李国锋 王光锁 孙学峰 丁培堃 彭彬

临床中，非小细胞肺癌起病隐匿且患者术后远期生存率较低[1]，因此，探究其发病机制及分子生物学特征，明确早期诊疗靶标意义重大。长链非编码RNA(lncRNA)为不编码蛋白质RNA，可调控基因的表达[2]。结肠癌相关转录子1(CCAT1)为lncRNA的一种，最早被发现高表达于结肠癌组织中，近年有研究报道，lncRNA CCAT1在多种恶性肿瘤中表达异常[3-4]。但临床对lncRNA CCAT1与非小细胞肺癌的关系报道较少。因此，本研究对100例非小细胞肺癌患者进行研究，现报道如下。

资料与方法

一、标本来源

收集2018年1月至2019年12月于我院就诊的100例经手术病理确诊的非小细胞肺癌患者的术后癌组织，同时收集癌旁正常组织，均经病理证实为正常肺组织。将收集的新鲜组织经液氮冷冻处理，保存于-80℃的冰箱中待用。

二、细胞培养

非小细胞肺癌细胞株A549细胞购于南京森贝伽生物公司，细胞生长于含10% 小牛血清的DMEM培养基中常规培养，培养箱设置为5% CO2、37℃，每2天换液一次。

三、方法

1 RT-qPCR法检测

取50mg样本组织超声匀浆，严格按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，试剂盒购于美国GeneCopoeia公司，RNA纯度和浓度应用上海奥析科学仪器有限公司生产的紫外分光光度计检测。逆转录反应按逆转录试剂盒说明书操作，试剂盒购于赛默飞世尔科技公司，反应体系为20μL，反应条件：45℃反应5min，37℃反应10min，95℃反应30s。RT-qPCR扩增反应根据STBR Premix Ex Taq试剂盒说明书操作，试剂盒购于大连宝生物有限公司，反应体系为20μL，反应条件：75℃反应30s，72℃反应15s，60℃反应5min，95℃反应30s，共40个循环。lncRNA CCAT1引物由上海生工生物工程公司合成，内参GAPDH，以2-ΔΔCt表示目的基因的表达，lncRNA CCAT1相对表达量=2-ΔΔCt值(lncRNA CCAT1)-2-ΔΔCt值(GAPDH)。

2 lncRNA CCAT1质粒的构建及转染

设计合成lncRNA CCAT1质粒，由大连宝生物有限公司合成，严格按照转染试剂盒说明书操作，试剂盒购于上海书吉生物科技有限公司，将lncRNA CCAT1质粒与空载体转染至A549细胞，于72h后收集转染细胞，采用RT-qPCR法检测重组质粒在A549细胞中lncRNA CCAT1的表达。

3 流式细胞术

收集转染48h后的A549细胞与未转染的A549细胞，根据流式细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，试剂盒购于北京凯瑞基生物科技有限公司，采用美国BD公司生产的流式细胞仪于细胞染色25min内进行检测。

4 噻唑蓝(MTT)实验

将转染的lncRNA CCAT1质粒、空载体的A549细胞及未转染的A549细胞接种于96孔板，每组3个复孔，采用MTT法检测培养转染48h、72h、96h后的细胞增殖情况。

四、统计学分析

结 果

一、组织样本中lncRNA CCAT1的表达分析

非小细胞肺癌组织中lncRNA CCAT1的相对表达量为(4.13±0.79)，明显高于癌旁正常组织(2.28±0.56)，二者比较差异显著(t=19.105，P<0.05)(见图1)。

图1 组织样本中lncRNA CCAT1的表达

二、lncRNA CCAT1对A549细胞凋亡及增殖的影响

RT-qPCR结果提示，与转染空载体阴性对照组和未转染对照组比较，转染lncRNA CCAT1质粒的A549细胞中lncRNA CCAT1表达较低(F=4.259，P<0.05)。流式细胞术结果提示，与转染空载体阴性对照组和未转染对照组比较，转染48h后lncRNA CCAT1质粒的A549细胞凋亡比例明显较低(χ2=3.854，P<0.05)。MTT结果提示，与转染空载体阴性对照组和未转染对照组比较，转染48h、72h、96h后lncRNA CCAT1质粒的A549细胞增殖能力均较高(F=3.916/5.073/3.297，P<0.05)。

三、lncRNA CCAT1的表达与非小细胞肺癌患者临床特征的关系

不同临床分期、淋巴结转移与非小细胞肺癌组织中lncRNA CCAT1的表达存在差异(P<0.05)(见表1)。

表1 lncRNA CCAT1的表达与非小细胞肺癌患者临床特征的关系

讨 论

lncRNA为非编码RNA，具有多功能性，其在多种肿瘤细胞中表达失调，发挥促癌或抑癌作用[5]。有研究报道，lncRNA可通过多种信号通路影响非小细胞癌的形成和进展，可能成为潜在的诊断标记物[6]。CCAT1为2628个核苷酸长度的非编码RNA，位于转录因子c-MYC附近，其在染色体8q24.21上的位置非常重要，因该区域曾被描述为“热点”[7-8]。有研究表明，从结肠癌患者获得的肿瘤细胞系和组织中CCAT1表达上调，且这种上调表达在恶性前病状和疾病发生进展过程中均很明显，包括晚期转移性疾病，提示CCAT1在肿瘤发生和转移过程中均起作用[9]。而在正常肝脏和小肠组织中CCAT1表达极少，甚至在许多其他人体组织中未检测到CCAT1的表达[10]。

本研究显示，非小细胞肺癌组织中lncRNA CCAT1的相对表达量高于癌旁正常组织，结果提示，lncRNA CCAT1可能与非小细胞肺癌有关，其在癌组织中呈高表达。王宁新等[11]学者研究发现，非小细胞肺癌患者血浆中lncRNA CCAT1表达上调，其对非小细胞肺癌有一定诊断价值。本研究通过分析lncRNA CCAT1与患者临床特征发现，不同临床分期、淋巴结转移与非小细胞肺癌组织中lncRNA CCAT1的表达存在差异，结果提示，过表达的lncRNA CCAT1可能与非小细胞肺癌的发生进展有关，其可能发挥促癌基因的作用。单廷等[12]学者对62例胃癌患者研究，发现lncRNA CCAT1在胃癌中呈高表达，且与胃癌的进展有关。陈思思等[13]学者报道，肝癌细胞中lncRNA CCAT1表达升高，且与肝癌临床分期、门静脉癌栓有关。因此，我们推测lncRNA CCAT1过表达可能促进恶性肿瘤发生进展过程。

本研究显示，转染lncRNA CCAT1质粒的A549细胞中lncRNA CCAT1表达较低。流式细胞术结果提示，转染48h后lncRNA CCAT1质粒的A549细胞凋亡比例明显较低。MTT结果提示，转染48h、72h、96h后lncRNA CCAT1质粒的A549细胞增殖能力均较高。以上细胞实验结果提示，下调lncRNA CCAT1的表达可抑制非小细胞肺癌细胞的凋亡、增殖，推测lncRNA CCAT1可能是非小细胞肺癌防治的新靶点。刘丽云等[14]学者研究报道，lncRNA CCAT1在人乳头状甲状腺癌组织中呈高表达，下调lncRNA CCAT1的表达可抑制细胞运动能力。潘洪丽等[15]学者对91例子宫内膜癌患者研究发现，lncRNA CCAT1与子宫内膜癌恶性程度有关，沉默表达 CCAT1可抑制癌细胞的迁移、侵袭。这说明lncRNA CCAT1在肿瘤细胞的凋亡、增殖、迁移、侵袭等过程中发挥促进作用。

综上所述，lncRNA CCAT1在非小细胞肺癌组织中呈高表达，下调lncRNA CCAT1的表达可诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖，其或将成为非小细胞肺癌的潜在治疗靶点。