长链非编码RNA PCAT19通过负调控p53水平促进非小细胞肺癌细胞的增殖

刘艳红 贾金广 王富霞

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在所有肺癌中占80%[1-2]。在男性和女性的癌症相关死亡率中，肺癌分别占26%和25%[3]。经过积极的手术切除、化学和放射治疗后I期肺癌中不到50%的患者和Ⅳ期癌症中不足5%的患者在初诊后的生存时间超过五年[4]。在过去的几十年中，肺癌患者的总生存率并未显著提高，这主要由于早期就诊率低，大多数肺癌患者确诊时已处于晚期阶段[5]。p53为一种抑癌基因，经过基因组测序发现在多种肿瘤中失活，导致细胞失去控制无限增殖[6]。p53参与癌症的发展受特定的长链非编码(lnc)RNA的调控[7]，lncRNA家族不可编码蛋白质，可通过调节基因表达参与许多细胞过程[8]。前列腺癌相关转录物19(PCAT19)已被证明可以激活与前列腺癌进展相关的细胞周期基因，从而促进肿瘤的生长和转移[9]，另外还发现PCAT19也可以促进喉癌的发展[10]。本研究主要检测lncRNA PCAT19在非小细胞肺癌中的表达水平及对非小细胞肺癌进展的影响。

资料与方法

一、一般资料

选取2013年1月至2015年1月在郑州市人民医院接受手术治疗的NSCLC患者78例，男性52例，女性26例，年龄37～71岁，术后进行常规化疗。收集患者的肿瘤组织和对应癌旁组织(距离肿瘤边缘≥5cm)。收集患者的一般临床资料包括：性别、年龄、病理类型、分化程度、病理分期、淋巴结转移和术后5年生存率。本研究经医院伦理委员会批准，患者同意并签署知情同意书。

二、实验材料

非小细胞肺癌细胞A549购于上海细胞生物学研究所；RPMI1640培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、MTT粉末等购于北京鼎国有限公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司；PCAT19和p53一抗和二抗购于美国Cell Signaling Technology公司；PCAT19质粒、PCAT19干扰质粒(PCAT19-siRNA)和p53质粒由北京华大基因合成。

三、方法

1 细胞培养和转染实验

A549细胞均培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素培养基中，37℃、5% CO2条件下常规培养，待细胞密增生长到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，取对数生长期的细胞进行转染实验。A549细胞以104个/孔的密度接种于6孔细胞板，常规培养24h，细胞融合度约为70%时，将对数生长期的A549细胞随机分为PCAT19组(转染PCAT19质粒)、siRNA组(转染PCAT19-siRNA质粒)、NC组(转染阴性对照质粒)、对照组(未转染质粒)、PCAT19+p53组(转染PCAT19和p53质粒)，按照脂质体lipofeetamine 2000说明书步骤操作，转染6h后，更换新鲜培养基，继续培养48h，收集各组细胞，qRT-PCR检测转染效果。

2 qRT-PCR实验

收集组织和细胞样品根据试剂盒说明书提取组织和细胞中的总RNA，反转录为cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明进行实时定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作为内参照。引物设计如下：PCAT19上游引物序列5′-TCAGAAC AGGGAACCATTGG-3′，下游引物序列5′-CAAG AAGATTCTTATCAGC T-3′，野生型p53上游引物序列5′-GCCCAACAACACCAGCTCCT-3′，下游引物序列5′-CCTGGGCATCCTTGAGTT CCT-3′，GAPDH上游引物序列5′-AGAAAAACCTGCCAAAT ATGATGAC-3′，下游引物序列5′-TGGGTGTCGCTGTT GA AGTC-3′。采用ΔΔCt 法计算mRNA水平。NSCLS组织中PCAT19 mRNA的表达水平高于癌旁组织中的水平定义为PCAT19高表达，低于癌旁组织中的水平定义为PCAT19低表达。

3 Western blot实验

收集PCAT19组、siRNA组、NC组、对照组细胞中的总蛋白。用BCA蛋白定量取30μg的蛋白，并配置5 %的浓缩胶15 %的分离胶进行SDS-PAGE电泳，将蛋白湿转至PVDF膜上。用1% BSA室温封闭2 h、之后经过一抗孵育(1 ∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜)、TBST洗涤3次、二抗孵育(1 ∶4 000稀释，室温孵育1 h)、TBST洗涤3次后，在膜上滴加适量化学发光显色液并置于Amersham Imager 600凝胶成像系统中拍照。

4 细胞增殖实验

收集PCAT19组、siRNA组、NC组、对照组、PCAT19+p53组细胞以每孔5×103的密度接种于96孔板中，分别设置的培养检测时间为12h、24h、36h、48h、60h和72h，每个检测时间点设置6个平行孔，20μL MTT溶液加入检测孔中，继续孵育4h。然后去除上清，每孔加入150μL二甲基亚砜溶液，震荡5min然后用酶标仪检测570nm处的吸光度值(OD)，OD值与活细胞的数量成正比。

四、统计学方法

结 果

一、PCAT19在NSCLC组织中表达水平增加且降低患者的5年生存率

PCAT19在NSCLC组织中的平均表达水平显著高于癌旁组织(P<0.001)，其中55例患者NSCLC组织中PCAT19的表达水平高于癌旁组织(见图1A)。PCAT19高表达组与PCAT19低表达组患者在性别、年龄、病理类型和分化程度之间差异无统计学意义，在TNM分期和淋巴结转移之间有差异(见表1)，且PCAT19高表达组患者的5年生存率显著低于PCAT19低表达组(见图1B)。

表1 PCAT19高表达与PCAT19低表达患者的临床资料比较[例(%)]

图1 PCAT19在NSCLC组织中表达水平增加且降低患者的5年生存率

二、PCAT19的表达水平与p53成负相关

NSCLC组织中p53 mRNA相对表达水平显著低于癌旁组织，pearson 相关性分析结果显示NSCLC组织中PCAT19的表达水平与p53 mRNA呈负相关r=-0.279,P=0.014(见图2)。

图2 PCAT19的表达水平与p53成负相关

三、PCAT19负调控p53的表达

PCAT19质粒转染至A549细胞中其表达水平显著高于对照组和阴性对照组(见图3A)，PCAT19高表达组中p53 mRNA相对表达水平低于对照组和阴性对照组(见图3B)，PCAT19高表达组细胞中PCAT19蛋白水平高于对照组和阴性对照组，而p53蛋白水平低于对照组和阴性对照组(见图3C)。PCAT19-siRNA质粒转染至A549细胞中其表达水平降低(见图3D)，PCAT19低表达组中p53 mRNA相对表达水平高于对照组和阴性对照组(见图3E)，PCAT19低表达组细胞中PCAT19蛋白水平低于对照组和阴性对照组，而p53蛋白水平高于对照组和阴性对照组(见图3F)。

图3 PCAT19负调控p53的表达

四、PCA19T通过调节p53的水平影响A549细胞的增殖能力

经过细胞增殖实验检测显示，PCAT19高表达组细胞的增殖能力强于对照组和阴性对照组，PCAT19-siRNA组细胞的增殖能力弱于对照组和阴性对照组，PCAT19+p53组细胞的能力与对照组和阴性对照组差异无统计学意义，与PCAT19高表达组相比有所减弱(见图4)。

图4 PCAT19通过调节p53的水平影响A549细胞的增殖能力

讨 论

LncRNA 发挥作用的方式多种多样，不仅可与DNA相互作用，还可与蛋白质、RNA 或蛋白复合体结合相互作用，在转录水平、转录后水平及蛋白质水平发挥重要的调节作用。lncRNA 作为主要的调节性RNA，在表观遗传或遗传水平上调节基因的表达。lncRNA的作用在多种病理生理过程中均有研究，包括自闭症谱系障碍、癌症、心血管疾病、阿尔茨海默氏病和生殖发育等[11-15]。相同的lncRNA在不同类型的癌症中可能发挥相似的功能，例如HOX转录反义RNA在大多数癌症中被上调，其过表达促进癌细胞的侵袭和迁移，并抑制细胞凋亡[16]。但是，不同类型癌症的发病机理是不同的，因此在一种癌症中使用特定lncRNA的功能来推测或预测其在另一种癌症中的作用机制是不合理的。例如，lncRNA牛磺酸上调的基因1(TUG1)在许多恶性肿瘤中均被上调，并促进细胞侵袭和增殖[17]，然而，在最近的一项研究显示TUG1在进神经胶质瘤中的促进癌细胞凋亡，表明其在神经胶质瘤中发挥肿瘤抑制功能[18]。

现已研究显示PCAT19在前列腺癌和喉癌中促进癌症的进展，在喉癌中lncRNA PCAT19通过调节miR-182/PDK4轴促进喉癌细胞的增殖[9]。在前列腺癌中lncRNA PCAT19通过调控细胞周期基因子集，促进前列腺癌细胞的生长和转移[10]。在本研究中我们发现PCAT19在NSCLC组织中的表达上调，有可能成为NSCLC早期诊断的肿瘤标记物，提高NSCLC的早期诊断率。PCAT19与NSCLC患者的病理分期和淋巴结转移相关，PCAT19高表达组II-III期患者比例较高，发生淋巴结转移患者较多，且显著降低患者的5年生存率，有望成为NSCLC不良预后的检测指标。癌症生物学中的p53信号传导可以通过某些特定的lncRNA来调节，在本研究中结果显示PCAT19是p53的负调节剂，可影响NSCLC细胞的增殖。综上所述，PCAT19在NSCLC组织中上调，通过下调p53促进NSCLC细胞增殖，有望成为NSCLC早期诊断或不良预后的指标。