热处理对酶解蛋黄液功能特性和热稳定性的影响

李欢欢 陈伊凡 张 晋 唐宏刚 刘旭明 陆顺方 陈黎洪*

（1 浙江省农业科学院食品科学研究所 杭州310021 2 北京德青源农业科技股份有限公司 北京100094 3 杭州顺丰祥食品有限公司 杭州311108）

鸡蛋黄是一种优质的食品乳化剂，对油脂和水有很强的亲和力，是制造蛋黄酱、沙拉调味酱及烘焙食品时起乳化作用的重要配料[1]。蛋黄由上清浆质（Plasma）和沉淀颗粒（Granular）两部分组成，蛋黄浆质主要由85%的低密度脂蛋白和15%的卵黄球蛋白组成，而蛋黄颗粒主要由70%的高密度脂蛋白、16%的卵黄高磷蛋白和12%的低密度脂蛋白组成。蛋黄颗粒的溶解度较差，在自然状态下不能充分发挥其乳化能力，这限制了蛋黄作为天然乳化剂的应用[2]。提高蛋黄的乳化性不仅可以扩大蛋黄的应用范围，而且通过开发高附加值的蛋黄制品，可以提高国内卵黄制品的国际竞争力[3]。

提高蛋黄乳化性的方法主要以酶解改性为主，目前对于磷脂酶改性的研究最多，也是公认较为有效的方法[4-7]。用于蛋黄改性的磷脂酶主要有磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶D，改性后的蛋黄主要用于制作蛋黄粉，研究表明经磷脂酶改性后的蛋黄粉其乳化活性、乳化稳定性、乳化容量及乳液耐热性均显著提高[8-9]。磷脂酶改性所需的底物浓度较低，不能用于较高浓度的液态蛋改性。黄丹[10]的研究表明：使用磷脂酶PLA1 对蛋黄进行改性时，底物质量浓度超过0.22 g/cm3时反应体系黏度增加，最终变为半固体，影响反应的进行。蛋白酶改性也是提高蛋黄乳化特性的有效途径[2]。周頔[11]研究了不同来源的蛋白酶对脱脂蛋黄的蛋白功能性质的影响，结果表明不同蛋白酶酶解后的蛋白乳化性均提高，其中碱性蛋白酶酶解物的水解度为8%时乳化性最好。张诗思[2]的研究表明在较高浓度的蛋黄液中，胰蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解相比于单一蛋白酶酶解更能提升蛋黄液乳化性能（乳化容量、絮凝程度等）。Orcajo 等[12]采用胰蛋白酶对蛋黄颗粒进行改性，结果表明用酶解后的蛋黄颗粒制作的蛋黄酱在4～20 ℃下更稳定，而且比未酶解蛋黄颗粒制作的蛋黄酱的流变性能更好。本课题组的前期预试验结果也证明胰蛋白酶可以显著提高蛋黄液乳化特性，且在底物质量浓度为0.55～0.77 g/cm3的范围内进行酶解效果更好。目前对胰蛋白酶改性的研究还相对较少，以上研究表明，胰蛋白酶在提高蛋黄液乳化性方面值得深入研究。

在液态蛋制品的加工过程中，巴氏杀菌是关键技术之一，巴氏杀菌液蛋制品约占蛋制品总量的70%，巴氏杀菌处理是保证液态蛋微生物安全的必要手段。禽蛋中的蛋白质热凝固温度一般在60 ℃左右[13]，经过较高温度或较长时间热处理，会导致蛋白质变性，从而引起其功能性质下降[14-16]。各国采用的液态蛋杀菌温度不同，如美国农业部（USDA） 规定，液态蛋的杀菌在60 ℃不少于3.5 min，而英国推荐巴氏杀菌条件为64 ℃不少于2.5 min[17]。在法国，对巴氏杀菌条件没有硬性规定，杀菌温度在65～68 ℃处理2～5 min，确保肠炎沙门氏菌 （Salmonella Enteritidis） 和李斯特菌（Listeria monocytogenes）下降5～6 个对数值[16]。前人研究表明60 ℃及以下的巴氏杀菌温度对液态蛋的功能特性没有影响，而超过60 ℃液态蛋的起泡性和乳化性均下降[17-18]。

随着物流运输业的发展，企业对液态蛋的需求不断增加，围绕功能性蛋黄液制品的研究还在深入。胰蛋白酶改性是提高蛋黄液乳化性的一种有效方法，杀菌处理是功能性蛋黄液制备的必要手段，以往文献多围绕蛋黄乳化性这一指标进行功能特性评价，该单一指标不能准确表征热处理之后蛋黄功能性质的变化。目前文献中还未见热处理对胰蛋白酶改性蛋黄液功能特性及热稳定性的研究，本文将围绕这两点做进一步的探讨，旨在为功能性蛋黄液制品的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋：海兰褐鸡蛋，农科院菜市场。

常规化学药品和试剂均为化学纯或分析纯。氯化钠、十二烷基苯磺酸钠（SDS）、溴化钾、磷酸盐缓冲液（PBS）、碳酸钠、三氯乙酸、盐酸、氢氧化钠、乳酸、酪蛋白、L-酪氨酸，国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶（1∶250）、SDS-PAGE 预制胶、预染蛋白质Marker、免脱色染色液、Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒，杭州诺扬生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

离心机（5810R），德国Eppendorf 公司；水浴摇床（SHZ-A），常州金坛精达仪器制造有限公司；电子天平（ALB-224），德国赛多利斯集团公司；加热磁力搅拌器（78-1），温州标诺仪器有限公司；紫外分光光度计 （Agilent Cary 60），Agilent Technologies；高速匀浆机（T18），德国IKA 公司；冷冻干燥机（Scientz-10N），宁波新芝生物科技股份有限公司；傅里叶红外光谱仪（TENSOR 27），德国布鲁克公司。

1.3 试验方法

1.3.1 胰蛋白酶酶解蛋黄液的热处理 胰蛋白酶是一种碱性蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，其最适pH 7.8～8.5，最适温度37 ℃。胰蛋白酶改性条件为：70%（体积分数）的蛋黄液，0.1%的胰蛋白酶，37 ℃反应60 min 制备酶改性蛋黄液。随后改性和未改性蛋黄液采用水浴法进行热处理，热处理温度分别是60，64，68，72 ℃，热处理时间均为4 min，处理之后的蛋黄液一部分置于4 ℃条贮存备用，另一部分冻干备用。

1.3.2 乳化活性和乳化稳定性 吸取蛋黄液2 mL 加入18 mL 0.5 mol/L NaCI 溶液，混匀后加入10 mL 大豆油，10 000 r/min 条件下均质1 min，形成乳化液，迅速吸取20 μL 底液，用1 mg/mL SDS溶液稀释300 倍，以SDS 溶液为空白参比，分别测定0 min 时500 nm 处吸光度A0，以及稳定静置30 min 后的500 nm 处的吸光度A30。乳化活性和乳化稳定性按照式（1）、（2）计算[19]。

式中，N——乳化液的稀释倍数，300；C——未乳化前蛋黄水溶液中蛋白质质量浓度（g/mL）；φ——乳化液中油的体积分数，%；A0——0 min 时的吸光度值；A30——30 min 时的吸光度值；t——时间间隔，30 min；T——热力学温度，k。

1.3.3 蛋白质溶解度 称取100 mg 蛋白样品分散于10 mL 的去离子中，磁力搅拌30 min，20 ℃条件下12 000×g 离心20 min。上清液经适度稀释，采用Folin-酚法测定蛋白质含量[13]，采用Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒测定样品中蛋白质的含量，酶标仪测定A650计算蛋白质浓度。蛋白质的溶解度表示为上清液蛋白质量浓度占总蛋白质量浓度的百分比。

1.3.4 持水性和持油性 采用重量法测定持水性，取100 mg 改性和未改性的蛋黄冻干粉加入10 mL 蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌5 min，低速离心机2 500 r/min（1 100×g）离心20 min。小心去除上清液，称量沉淀的质量，持水性计算公式如下：

持油性也采用重量法测定。称取500 mg 改性和未改性的蛋黄冻干粉分别加入15 mL 大豆油，室温下经磁力搅拌器搅拌30 min，低速离心机2 500 r/min（1 100×g）离心20 min，小心去除上清液，称量沉淀的质量，持油性计算公式如下：

1.3.5 起泡性和泡沫稳定性 室温条件下（20℃）量取100 mL 蛋黄液，采用10 000 r/min 均质3 min，使其充分起泡，随后迅速将泡沫和溶液转移至250 mL 的量筒中，读取泡沫和液体的体积。将泡沫和液体的混合物静置10 min，再次读取泡沫和溶液体积。计算公式如下：

1.3.6 SDS-PAGE 利用SDS-PAGE 分析热处理对酶解蛋黄液蛋白质分子质量分布的影响。酶解蛋黄液用0.5 mol/L NaCl 溶液配成2 mg/mL 稀释液（20 μL 加入1 mL 0.5 mol/L NaCl），取10 μL 稀释液，加入40 μL 上样缓冲液，煮沸5 min，上样量10 μL。5%浓缩胶、12%分离胶，Marker 为250 ku。

1.3.7 蛋黄粉的红外光谱 采用傅里叶红外光谱仪对蛋黄粉官能团进行分析，称取不同处理的冻干蛋黄粉1～3 mg，按照1∶100～1∶150 的比例加入烘干的溴化钾，用研钵充分研磨混匀，随后采用压片机压成薄片，将其放入傅里叶红外光谱仪中扫描，波数范围为4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，波数精度0.01 cm-1，扫描32 次。

1.4 数据分析

试验结果用平均值±标准差表示，每项试验重复3 次取得平均值。数据绘图采用Origin 9.1 软件，数据分析和方差分析采用SPSS 20 分析软件，P<0.05 为显著性差异标准。

2 结果与分析

2.1 热处理对胰蛋白酶改性蛋黄液乳化活性和乳化稳定性的影响

乳化活性（EAI）反映了蛋白质形成并稳定乳状液的能力，而乳化稳定性（ESI）反映了乳化剂维持体系稳定的能力，因此EAI 和ESI 是衡量蛋白质乳化性能的重要指标[20]。热处理对改性和未改性蛋黄液的乳化活性和乳化稳定性如图1所示。在相同热处理条件下，胰蛋白酶改性蛋黄液的乳化活性均显著高于未经酶解改性处理的蛋黄液（P<0.05），其乳化活性分别比未改性蛋黄液高出139%（对照），122%（60 ℃），145%（64 ℃），95%（68℃）和98%（72 ℃）。对于酶解改性组，随着处理温度的提高，蛋黄液的乳化活性显著降低（P<0.05），从酶解之后的64.9 m2/g 显著降低到72 ℃处理后的31.6 m2/g，降低幅度达51.3%。对于未改性组，随着处理温度的升高，乳化活性呈显著下降趋势，从最初的的27.1 m2/g 减少到15.9 m2/g，减少41.3%。

酶解组和未酶解组的乳化稳定性随处理温度的升高呈上升趋势（图1），酶解组与未酶解组的乳化稳定性在64 ℃和72 ℃处理下差异显著（P <0.05）。这与前人[14，21]的研究结果相似，酶解处理相比不酶解处理可提高同等热处理条件下蛋黄液的乳化活性，乳化稳定性随处理温度升高而增加。苏宇杰等[14]研究了不同热处理温度对蛋黄上清浆质和颗粒乳化性的影响，结果表明较低温度（小于60 ℃）的热处理对蛋黄浆质和颗粒的乳化性没有影响，而68 ℃处理较长时间会使其乳化活力下降，乳化稳定性提高。

2.2 热处理对酶改性蛋黄液蛋白质溶解度的影响

图1 热处理对胰蛋白酶改性蛋黄液乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）的影响Fig.1 Effect of heat treatments on emulsification activity and emulsification stability of egg yolk hydrolyzed with trypsin

图2 不同热处理对酶改性蛋黄液蛋白质溶解度的影响Fig.2 Effect of different heat treatments on protein solubility of egg yolk hydrolyzed with trypsin

蛋白质的溶解性可以影响蛋白质的其它性质，如起泡性、乳化性、凝胶性、吸水性、保水性、增稠性等，不溶性的蛋白质应用范围有限[14]。从图2可以看出，在同等热处理条件下，胰蛋白酶改性蛋黄蛋白质的溶解度差异显著高于未酶解组（P <0.05），分别是未改性组的2.24 倍（对照）、2.14 倍（60 ℃）、1.99 倍（64 ℃）、1.28 倍（68 ℃）和1.49 倍（72 ℃）。相对于酶解组，热处理显著降低蛋黄蛋白质的溶解度（P < 0.05），当热处理温度超过68 ℃后，蛋白质溶解度差异不显著，而对于未酶解组，热处理温度从60 ℃升高到68 ℃时，蛋白质溶解度较对照组显著下降，而彼此差异不显著。Denmat 等[22]的研究表明，热处理温度从55 ℃升高到69 ℃，蛋黄蛋白质溶解度变化不显著（P>0.05），温度在69～76 ℃，蛋黄蛋白质溶解度显著降低40%。这与本研究未酶解组的结果相似，可能与蛋黄液在68 ℃及以上温度处理后的表观黏度迅速增加有关。

2.3 热处理对酶改性蛋黄持水性和持油性的影响

持水性是指蛋白质吸收水分的能力，持水性在1.49～4.74 g/g 之间的蛋白质可以应用于流动性食品中[23]。热处理对酶改性蛋黄持水性的影响见图3。酶解组与未酶解组的持水性表现出相似的趋势。同等热处理条件下，酶解蛋黄的持水性分别比未酶解蛋黄高13.2%（对照），6.12%（60 ℃），4.71%（64 ℃），4.97%（68 ℃） 和3.94%（72 ℃），差异显著（P<0.05）。相较于对照组，60 ℃处理下的酶解组和未酶解组持水性均显著下降，随着处理温度的升高持水性显著升高。蛋白质持水性被证实与蛋白质构象、氨基酸组成、表面极性、表面疏水性等相关[24]，酶解处理可使蛋黄蛋白质肽键断裂，肽段的亲水基团增加，导致亲水性增强。热处理可以破坏蛋白质的二级结构，使原处于分子内部的疏水基团暴露，不能与水相溶，容易引发分子间相互碰撞而聚集。

持油性是表征蛋白质侧链上非极性氨基酸与油脂结合能力的参数。蛋白质与脂肪结合可改善碎肉和焙烤制品的质构，减少产品质量损失[25]。热处理对酶解和未酶解蛋黄持油性的影响如图3所示，酶解组和未酶解组蛋黄持油性在不同热处理条件下表现出不同的趋势。相比于对照组，热处理可以显著降低未酶解组蛋黄的持油性，其中在72℃处理下，持油性显著下降，是不经热处理（对照组）的83%；对于酶解组，60，64 ℃和68 ℃处理下，持油性显著下降，而在72 ℃处理条件下，持油性与未经热处理的样品无差别。

图3 不同热处理对改性蛋黄持水性和持油性的影响Fig.3 Effect of different heat treatments on the water absorption capacity and the oil absorption capacity of egg yolk hydrolyzed with trypsin

2.4 热处理对酶改性蛋黄液起泡性和泡沫稳定性的影响

热处理对改性蛋黄液起泡性和泡沫稳定性的影响见图4。酶解和未酶解的蛋黄液在不同热处理条件下，表现出相似的趋势，即热处理可以显著降低蛋黄液的起泡性，且起泡性随处理温度的升高而呈下降趋势。在相同热处理条件下，酶解蛋黄液的起泡性能均显著高于未酶解蛋黄（P<0.05）。酶解可以提高蛋黄的起泡性，这可能是因为酶解处理可以将蛋白质降解为较小的肽段，这些较小的肽段可以更容易的聚集在液体界面，从而形成泡沫[26]，而加热处理会破坏蛋黄蛋白质的二级结构，增加蛋白内部疏水基团的暴露程度，促使内源蛋白质分子形成非共价聚集体，增大蛋白质颗粒的体积，然而过大或过小的蛋白质颗粒均不利于泡沫的形成。

相比于其它热处理条件，酶解蛋黄液的泡沫稳定性在72 ℃处理下显著提高；而未酶解蛋黄液在64 ℃和68 ℃处理条件下显著下降，对照组、60℃和72 ℃处理条件下泡沫稳定性无差异。蛋白质的泡沫稳定性与其表面疏水性、分子质量分布等有密切关系[27]。Celus 等[28]研究发现啤酒蛋白经蛋白酶水解后的泡沫稳定性与14 500 u 以上肽段占总蛋白比例的多少呈显著正相关，这说明疏水性颗粒大小适中的肽段所占比例越高，越有利于增强泡沫稳定性。徐旭东等[29]的研究结果表明40～60 ℃热处理会显著提高蛋黄液的起泡能力和泡沫稳定性，这可能说明较低的温度可提升蛋黄液起泡能力和泡沫稳定性，而较高的温度（60～72 ℃）会使其降低。

图4 不同热处理对改性蛋黄起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.4 Effect of different heat treatments on foaming capacity and foam stability of egg yolk hydrolyzed with trypsin

2.5 热处理对酶改性蛋黄蛋白质变性程度的影响

蛋黄经过简单的离心可以分为上清浆质和颗粒，上清浆质主要由85%的低密度脂蛋白和15%的卵黄球蛋白组成，蛋黄颗粒主要由70%的高密度脂蛋白、16%的卵黄高磷蛋白和12%的低密度脂蛋白组成[22]。高密度脂蛋白主要包括3 种脱辅基蛋白质，分子质量分别为32，80，105 ku；低密度脂蛋白主要包括4 种脱辅基蛋白质，分子质量分别为15，70，140，175 ku；卵黄蛋白主要有α，β，γ 3 种异构体，分子质量分别为85，42，65 ku[1]。

图5 不同热处理条件下未酶解和酶解蛋黄液的SDS-PAGE 图谱Fig.5 SDS-PAGE profile of liquid egg yolk hydrolyzed with / without trypsin

利用SDS-PAGE 检测热处理对未酶解和酶解蛋黄液蛋白质分子质量的变化，如图5所示。相对于未酶解组，不同热处理条件下的蛋白质谱图较相似，部分条带的含量发生变化：与不经热处理的条带相比，热处理后，250 ku 左右的蛋白质（条带2）增加，且72 ℃下的蛋白质条带明显减少，说明热处理使蛋白质发生了聚集；100 ku 左右的蛋白质（条带5）和35 ku 左右的蛋白质（条带13）消失；35～70 ku（条带9，11 和14）分子质量范围内的部分蛋白质含量增加，70～150 ku （条带4 和8）分子质量范围内的蛋白质含量减少，总体来说，加热使蛋白质条带减少。

由图谱可知胰蛋白酶酶解可以使蛋黄液蛋白质分子质量发生明显变化，变化的分子质量主要集中在20～35 ku（条带15～18）和70～150 ku（条带2～9），这主要是高密度脂蛋白、部分低密度脂蛋白和部分卵黄蛋白的分子质量分布区。不经热处理、60 ℃和64 ℃热处理条件下蛋黄液具有相似的蛋白质谱图，68 ℃和72 ℃处理下20～35 ku 的蛋白质消失，70～150 ku 的蛋白质含量增加，这说明该温度处理条件下蛋白质发生明显聚集。张诗思[2]的研究表明酶解后的蛋黄液蛋白质条带主要分布在130 ku 以下，其中125，113，98，74 ku 及大部分35 ku 以下的条带均为水解产生的新条带，这与本文结果相似。250 ku 左右的条带可能是卵黄蛋白原，该条带没有在酶解组出现，这可能是因为该蛋白质在蛋白酶的作用下能够裂解为apolipovitellins-Ⅰ（相对分子量约为125 ku）和apolipovitellins-Ⅱ（相对分子量约35 ku）[30]。温和热处理（60 ℃和64℃） 可以相对保持酶解后蛋白质分子质量的多样化分布。

2.6 热处理对酶改性蛋黄蛋白质二级结构的影响

傅里叶变换红外光谱是研究蛋白质二级结构的一种热门处理方式，它使用样品少，且不受蛋白质状态、浓度、环境等的影响[19]。研究表明绝大多数有机化合物的基频震动出现在4 000～400 cm-1的中红外区。蛋白质在红外光谱区有若干个特征吸收峰，3 200～3 600 cm-1的吸收峰代表了-OH 的伸缩振动，2 800～3 000 cm-1代表了-CH 的伸缩振动，1 600～1 700 cm-1是氨基Ⅰ键中C=O 的伸缩振动，1 500～1 600 cm-1是氨基Ⅱ键C-N 伸缩振动和N-H 的弯曲振动[31]。未酶解和酶解样品经不同热处理后的傅里叶红外光谱图如图6所示，在未酶解组的对照组样品中，有11 个较强的吸收峰，分别位于3 407，2 924，2 853，2 745，1 654，1 545，1 465，1 236，1 164，1 093 和721 cm-1，其中3 407 cm-1附近是水分的伸缩振动吸收峰，2 924 cm-1和2 853 cm-1附近是油脂的吸收峰，1 646 cm-1附近是蛋白的吸收峰，1 164 cm-1附近是蛋黄中碳水化合物的吸收峰，这与葛绍阳等[5]的结果较一致。加热处理使样品-OH 特征吸收峰发生了偏移，未酶解蛋黄的特征峰为3 407 cm-1，不同热处理之后，特征吸收峰为3 298 cm-1（60 ℃），3 302 cm-1（64℃），3 405 cm-1（68 ℃）和3 424 cm-1（72 ℃）。

图6 不同热处理条件下未酶解和酶解蛋黄液的红外光谱图Fig.6 FTIR spectrum of liquid egg yolk egg yolk hydrolyzed with / without trypsin

酶解组经不同热处理后的光谱图较相似，都拥有11 个较强的吸收峰，相较于对照组，热处理可以使酶解组蛋黄的-OH 特征吸收峰发生明显偏移，分别从3 417 cm-1（对照）变为3 405 cm-1（60℃），3 415 cm-1（64 ℃），3 405 cm-1（68 ℃）和3 405 cm-1（72 ℃），说明胰蛋白酶和热处理对蛋黄-OH官能团的作用较明显。酶解组红外谱图与低密度脂蛋白的红外谱图[32]相似，说明蛋黄蛋白质二级结构较稳定。

3 结论

1）胰蛋白酶改性可以显著提高蛋黄液的乳化活性和乳化稳定性。在同等热处理条件下，乳化活性和乳化稳定性比未酶解处理提高98%（72℃）～122%（60 ℃） 和6.59%（68 ℃）～25.5%（72℃）；同等热处理条件下，酶改性组的功能特性如蛋白质溶解度、持水性和持油性、起泡能力和泡沫稳定性均好于未改性组，证明了胰蛋白酶改性处理在功能性蛋黄液制备中的作用；

2）SDS-PAGE 结果显示酶改性组蛋黄液不经热处理、60 ℃和64 ℃热处理明显改变了蛋白质分子质量的分布，68 ℃和72 ℃下使蛋白质分子发生了聚集；FTIR 红外谱图结果表明酶解处理和热处理主要改变蛋黄-OH 官能团；

3）60～64 ℃左右的热处理对70%底物浓度的胰蛋白酶改性蛋黄液较适宜，功能特性的下降程度比其它温度下的低。接下来的研究需要考虑到微生物的安全性，以探寻更合适的巴氏杀菌温度。