高产胞外多糖旧金山乳杆菌的筛选及其在馒头中的应用

张国华 张纬珍 王 淇 梁星星 高 洁

（1 山西大学生命科学学院 太原030006 2 河北农业大学食品科技学院 河北保定071000）

胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生长代谢过程中产生并分泌到细胞壁外的一类水溶性糖类化合物[1]，按其所在位置的不同分为荚膜多糖[2-3]和黏液多糖[4]，按多糖的组成可分为同型多糖和异型多糖，其功能特性主要取决于EPS 组成、分子质量大小及结构[5-6]。

近年来，研究发现乳酸菌胞外多糖可以替代亲水胶体[7]，起到改善面包体积、质构、营养价值及抗老化等方面的作用，因而受到越来越多的研究者关注。Tamani 等[8]研究发现酸面团来源的乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus LB18，L.delbrueckii subsp.bulgaricus CNRZ 737，L.delbrueckii subsp.bulgaricus 2483），在面团发酵过程中产生的EPS 可起到增加面包体积，抗面包老化的效果，而不产EPS 的酸面团来源的乳酸菌（Lactobacillus helveticus LH30） 对面包品质及老化并没有作用，其原因可能是乳酸菌产生的EPS增强面包保水性，进而改善面包品质及老化特性。Xu 等[9]研究发现蔗糖的添加有助于提高明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides DSM 20193）的EPS 产量，而且EPS 含量多少直接影响蚕豆面团理化特性及流变特性。国内研究也发现产EPS 的乳酸菌对馒头感官品质、比容、硬度等有显著改善。李志建等[10]研究发现产EPS 的植物乳杆菌与酵母菌以100︰1 的比例添加到面团中，会显著降低发酵面团的pH 值、还原糖含量及馒头的硬度，并提高馒头的白度等。杨晓露等[11]研究也发现添加了高产EPS 的植物乳杆菌L1 （L.plantarum L1）制备的馒头比容明显增大，白度略微增大，感官评分较高。

目前，虽然活性干酵母已作为单一菌种应用于面制品的发酵生产，但是与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头口感单一，风味略显不足，总体的感官品质低，复蒸性能差[12]。关于传统发酵酸面团中优势乳酸菌——旧金山乳杆菌（L.sanfranciscensis）[13]对馒头品质、风味及老化特性的系统研究尚属空白。为解决传统发酵主食馒头工业化发展中实际问题和推进传统发酵主食工业化发展进程，本文从实验室保藏的51 株旧金山乳杆菌中筛选出1 株高产胞外多糖的旧金山乳杆菌Ls-1001，并将其应用于馒头的制作，为今后老面馒头工业化发展提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

51 株旧金山乳杆菌（L.sanfranciscensis）由本实验室提供。

mMRS 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉浸粉10 g/L，麦芽糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸铵 2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温80 1 mL/L，pH 5.4。

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、乙醇、三氯乙酸均为分析纯级试剂。

香满园优质特精小麦粉，益海嘉里食品营销有限公司；超市购买的某品牌活性干酵母。

LY01-3 厌氧培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；PHS-3C 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；SP-2000UV 紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DSX-280B 型手提式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；YLY-XH-100AD实验室超纯水机，深圳市亿利源水处理设备有限公司；SC-3614 低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；HC-3018R 高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；78-1 磁力加热搅拌器，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 旧金山乳杆菌的活化与培养 将冻存的51 株旧金山乳杆菌分别接种到mMRS 液体培养基内，30 ℃恒温厌氧培养箱（N2∶CO2∶O2=79∶20∶1）内培养48 h，活化2～3 次后备用[14]。活化后的菌液按体积分数1%[15]的接种量接种到mMRS 培养基中30 ℃培养24 h 得到发酵液，待用。

1.2.2 旧金山乳杆菌胞外多糖的提取 旧金山乳杆菌发酵液中加入80%TCA，调节TCA 质量分数至4%[16]，4 ℃，10 000 r/min 离心20 min[17]，以除去菌体和蛋白质。向上清液中加入4 倍体积的无水乙醇[18]，4 ℃过夜放置，析出多糖絮状沉淀。再次离心去除上清液，用蒸馏水溶解沉淀，装入截留分子质量为8～14 ku 的透析袋中，透析8～12 h，透析液为蒸馏水。

1.2.3 旧金山乳杆菌胞外多糖的测定及高产胞外多糖菌株的筛选 胞外多糖含量采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，计算EPS 产量[19-20]。

准确称取100 mg 干燥的葡萄糖于500 mL 容量瓶中，蒸馏水定容。分别取标准葡萄糖溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL 加入具塞刻度试管中，补水至2.00 mL，再加入1.00 mL 体积分数5%的苯酚溶液、5.00 mL 浓硫酸混匀静置，待其冷却后于490 nm 波长处测定吸光度，同时以蒸馏水为空白，每组做3 次平行试验。以糖含量（mg/L）为横坐标，吸光度（A490nm）为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程，求出胞外多糖含量，进而可初步筛选出EPS 高产菌株。

1.2.4 旧金山乳杆菌的应用

1.2.4.1 馒头的制备方法 旧金山乳杆菌菌泥的制备：将培养24 h 的旧金山乳杆菌发酵液在3 000～4 000 r/min 离心4～5 min，弃上清，收集沉淀得到旧金山乳杆菌菌泥。

馒头的制备采用二次发酵法，将旧金山乳杆菌菌泥溶于20 mL 自来水后，加入20 g 小麦面粉搅拌成面糊，在30 ℃发酵12 h，制备种面糊。向种面糊中加入2 g 活性干酵母、180 g 小麦面粉、90 mL 自来水，搅拌成团，30 ℃发酵60 min，分割成型，入锅前醒发30 min，蒸制30 min，冷却即得成品。

1.2.4.2 馒头水分含量、比容的测定 馒头水分、比容根据GB 5009.3-2016、GB/T 21118-2007 进行测定，试验重复3 次。

1.2.4.3 酸面团pH 与总酸度的测定 称取二次发酵的酸面团10 g，加入90 mL 蒸馏水，将酸面团摇匀，以pH 计测定酸面团的pH 值。用0.1 mol/L的NaOH 溶液滴定至pH 8.5 为止，记录所消耗的NaOH 的体积即为该酸面团样品的总酸度值，试验重复3 次[21]。

1.2.4.4 馒头的感官评价 测定感官评分规则：取冷却时间在20 min 内的馒头（此时记为0 h）测定0 h 感官评分，再将其在（25±2）℃放置48 h，分别测定放置24，48 h 的感官评分。

参考GB/T 21118-2007 感官分析方法（见表1），将馒头切成数块，由10 人品评小组进行品评，满分100 分，试验重复3 次，取平均值。

1.3 数据处理

每组试验重复3 次，采用Excel 2013 和SPSS 15.0 软件对数据进行处理，所有结果均采用Mean±SD 表示，显著性分析（P<0.05，P<0.01）利用ANOVA 进行分析比较。

表1 感官评分表Table 1 Sensory score table

2 结果与分析

2.1 高产胞外多糖菌株的筛选

对51 株旧金山乳杆菌胞外多糖产量的筛选结果如图2所示，其中高产胞外多糖旧金山乳杆菌共7 株，分别为Hb1（187.31 mg/L），Gs7（185.47 mg/L），Ls-1001（190.32 mg/L），Gm2（183.70 mg/L），Hr8 （185.84 mg/L），Gs1 （186.60 mg/L），Gs5（188.48 mg/L），试验结果表明同种不同株旧金山乳杆菌在产胞外多糖这一特性上具有差异性。由于Tinzl-Malang 等[22]研究发现将魏斯氏菌和费氏丙酸杆菌以1∶1 的比例发酵，胞外多糖产量为1.5 g/kg 面团，制备的面包的质构、感官及老化特性都得到显著改善，可有效延长产品货架期。此外，乳酸菌胞外多糖具有增稠性能，在面包生产过程中能代替胶体物质改善面团的流变性和机械加工性，使面包的体积增大，改善面包的质地，延长保质期，对面制品的老化有抑制作用[23]。因此选择胞外多糖产量最高菌株旧金山乳杆菌Ls-1001 用于馒头的制作。

2.2 馒头的制作

通过测定胞外多糖含量筛选出一株高产胞外多糖旧金山乳杆菌菌株Ls-1001，其菌种保藏号：CGMCC No.14232，将其应用于馒头的制作。试验共分4 组，第1 组为对照组：活性干酵母（1 g/100 g面粉）馒头；第2 组、第3 组、第4 组为试验组，旧金山乳杆菌的添加量分别为9.75×1014，1.95×1015，2.93×1015CFU/100 g 面粉。

图1 胞外多糖测定标准曲线Fig.1 Standard curve of determining EPS

2.2.1 馒头水分含量、比容的测定 由图3可知，与只添加活性干酵母发酵馒头相比，旧金山乳杆菌的添加降低了馒头的水分含量且添加量越大水分含量越低；第2 组、第4 组馒头的水分含量随着时间的延长逐渐下降，而第1 组与第3 组馒头在贮藏过程中水分含量先增加后降低，原因可能是馒头在贮存后期保鲜袋内环境湿度较大，可能导致馒头吸收袋内水分而使水分含量增大，随着淀粉的进一步老化，持水性下降从而使保水性有所下降[24]。由图4可知，适当的添加旧金山乳杆菌可增加馒头的比容，当旧金山乳杆菌的添加量为1.95×1015CFU/100 g 面粉时，馒头比容最大为1.97，结果表明旧金山乳杆菌能有效改善面制品结构。Corsetti 等[25]研究表明酸面团中优势乳酸菌旧金山乳杆菌（L.sanfranciscensis CB1）、植物乳杆菌（L.plantarum13）与酿酒酵母的复合发酵，具有增大面包体积的效果，与本试验的研究结果相一致。

图2 不同菌株EPS 含量Fig.2 EPS content of different strains

图3 馒头水分的测定Fig.3 Determination of moisture in steamed bread

2.2.2 馒头酸面团pH 值与总酸度的测定 由图5可知，随着旧金山乳杆菌添加量的增加，酸面团的pH 值逐渐下降，总酸度逐渐增加，当旧金山乳杆菌添加量为1.95×1015CFU/100 g 面粉时，酸面团的pH 值最低为5.05，总酸度最高为7.97。以上两点均证明旧金山乳杆菌在面团发酵过程中具有产酸现象。国内研究表明酵母菌和乳酸菌（Lactobacillus brevis）混合发酵面团与干酵母发酵相比，总酸度较高，麦芽糖、蔗糖、果糖等可溶性糖变化差异显著[26]。Maligoy 等[27]发现与乳酸菌单独培养相比，酵母菌和乳酸菌混合培养时，乳酸菌的mRNA 水平上158 个重要基因发生了明显的调整，有54%的基因缺失表达，同时增加了46%的基因表达，而新增基因多是调节糖、氨基酸等代谢途径的关键基因，而这些产物有可能是馒头中的特征风味物质或者风味前体物质。

图4 馒头比容的测定Fig.4 Determination of specific volume of steamed bread

图5 酸面团pH 值与总酸度的测定Fig.5 Determination of pH value and total acidity of sourdough

2.2.3 馒头的感官评价 馒头的感官评分如表2所示，在4 种馒头中，添加了旧金山乳杆菌的馒头感官评分均高于干酵母馒头，且当旧金山乳杆菌添加量为1.95×1015CFU/100 g 面粉时即第3 组馒头的感官评分最高为90 分。结合图6可直观看出第3 组馒头在感官评价上滋味和气味、口感、内部结构明显高于其余3 种馒头，而在表皮色泽、表皮结构、内部弹性上4 种馒头感官评分相近，差异不明显，其中干酵母馒头的滋味和气味感官评分最低。原因是乳酸菌利用面团中可发酵糖，产生乳酸、醋酸及丙酸等有机酸，可与酵母发酵中产生的醇、醛等物质相互作用，形成新的风味物质如挥发性酸等[28]，对馒头的滋味和气味有明显的改善作用。而乳酸菌在酸面团发酵过程中合成的胞外多糖可以提高面团的劲度，改善面团的流变学性质以及面制品的结构品质[29]，因而添加了旧金山乳杆菌的馒头品质优于干酵母馒头。

图6 馒头感官评价雷达图Fig.6 Spider chart of sensory evaluation of the steamed bread

表2 馒头感官评价得分表Table 2 The Sensory evaluation of the steamed bread

3 结论

本试验以传统发酵酸面团中的优势菌种——旧金山乳杆菌为研究对象，通过苯酚-硫酸法筛选出一株高产胞外多糖旧金山乳杆菌菌株Ls-1001，其产量为190.32 mg/L。将其应用于馒头的制作中，结果表明旧金山乳杆菌的添加能降低馒头的水分，增加比容，降低酸面团的pH 值，增加总酸度，馒头的感官评分最高，具有老面馒头的香气，口感最好，对改善干酵母馒头的品质起到重要作用。