钙对氟中毒大鼠肾脏损伤和凋亡的影响

范俊江，王金明

(山西农业大学 动物医学学院，山西 晋中 030801)

氟是一种非常活泼的卤族元素，化学性质非常稳定，分布于自然界和人类生活的方方面面[1]。人们通常会通过饮水和食物摄入氟，当摄入氟的量超过机体的正常体内蓄积时，会出现“氟中毒”现象[2〗。氟中毒病不仅对人类的健康造成非常大的威胁，并且每年可对农业畜牧业造成数以万计的经济损失，严重影响了社会的健康进步和农业的绿色可持续发展。

近年来氟中毒的研究中报道了高氟暴露下机体组织器官的损伤，例如脑、睾丸、脾脏、肝脏、肾脏等[3]。其中肾脏普遍被认为是机体进行排氟最重要的器官，肾小球对氟具有很强的滤过作用，生物体内70%以上的的氟均由肾脏进行过滤和排出，同时大量的氟蓄积也会导致肾脏的组织结构和功能发生恶化[4]。

氟中毒还导致组织器官凋亡现象的发生[5]。在细胞的凋亡进程中，Caspase8蛋白和Caspase3蛋白是凋亡现象发生最为明显的特异分子[6]。细胞膜表面有大量的凋亡相关受体蛋白，可被激活参与细胞凋亡信号的发生和传递，其中Fas凋亡蛋白尤为重要，它属于肿瘤坏死家族，作为一种关键的跨膜蛋白，被激活后可以与其配体Fas-L进行相关特异性结合，最终活化Caspase家族凋亡蛋白，导致凋亡现象的发生[7]。

钙被认为是对治疗氟中毒最好途径之一，在氟中毒疾病高发地区，钙已经被广泛作为一种膳食添加物来对氟中毒等疾病进行预防[8]。钙在调节激素分泌、调节血压、控制机体排毒能力等发挥着不可忽视的作用。但是钙对氟中毒机体肾脏损伤的治疗效果和作用机制仍属未知。因此，试验建立氟中毒加钙的大鼠模型，饲喂0.5%钙浓度和1%钙浓度的饲料，检测肾脏相关的功能指标、肾结构形态变化，检测肾脏中凋亡蛋白的表达，为在生产实践过程中使用营养物质钙治疗氟中毒提出可靠的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用体重大小均为120±10 g，28日龄的健康雄性SD大鼠120只，均购买自山西医科大学实验动物中心。

1.2 试验模型设计

首先将大鼠进行一周的适应环境饲养，之后随机分为4组，每组30只，分别为对照组、氟组(100 mg·L-1F-)、氟 + 0.5% 钙组(F-+ 0.5% Ca)、氟 + 1% 钙组(F-+ 1% Ca)，分组如表1所示。饲养期间所有大鼠均采用自由采食和自由饮水的条件进行饲养，保持合适的温度和湿度，保证饲养环境的干净和安静。

表1 大鼠模型的建立

1.3 主要仪器和试剂

氟化钠、碳酸钙、氯化钠、乙醇、甲醛、二甲苯、HE染色试剂盒、中性树胶等试剂(购自北京索莱宝公司)；高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；WFJ 2100型可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；数显电热恒温水浴箱(北京市长风仪器仪表公司)；Y 9600 型电子分析天平(上海精密科仪器公司)；-80℃超低温冰箱(美国Thermo Forma公司)；血清肌酐(CRE)、尿酸(UA)检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)；Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白抗体和浓缩型DAB试剂盒(购自北京博奥森生物技术有限公司)。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 一般症状观察 试验周期内每天对大鼠的饮食、饮水、毛发、排泄物、精神状态等进行观察，并且详细记录。

1.4.2 生化指标测定 分别于不同试验周期30 d、60 d、90 d，每组大鼠中随机挑选10只大鼠，采用眼球采血的方式采取血液，一部分血液进行尿素氮(BUN)的测定，另一部分血液以3 000 r·min-1的条件低温速度离心10 min获得血清，进行肌酐(CRE)和尿酸(BUN)的测定，所有指标均按照南京建成生物工程研究所的试剂盒指导进行检测。

1.4.3 肾脏切片HE染色观察 试验90 d时，每组随机挑选5个肾脏组织，固定在10%福尔马林48 h，之后进行流水冲洗，切取合适大小的块状，根据HE染色试剂盒的说明进行石蜡包埋，石蜡切片，HE染色和封片，使用显微镜对切片进行观察和分析。

1.4.4 肾脏组织凋亡蛋白的检测 试验90 d时，每组随机挑选5个肾脏组织，放在10甲醛溶液进行固定48 h，流水冲洗后切取合适大小的组织进行常规乙醇脱水，石蜡包埋，石蜡切片，切片大小为4 μm，然后采用ASBC法对肾脏组织Fas、Fas-L、Caspase8和Caspase3蛋白进行化学染色，使用DAB显色法对切片进行显色，然后运用显微镜在同一条件下获取各个组中肾脏样本的试验图像，运用分析软件Image-Pro plus v.5.0 进行平均光密度分析，每个样本选取10张切片，每个切片随机挑选8个视野，分析每个视野中阳性区域面积的平光光密度值，然后进行差异显著性显著检验。

1.5 数据分析

数据用“均数±标准差( ±)”表示，采用LSD进行显著性检验，使用SPSS 23.0进行数据的分析与处理，P< 0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 大鼠生长状态

对照组大鼠生长正常，牙齿和毛发无异常，精神状态正常，尿液清亮，粪便颜色和质地正常；氟组大鼠生长正常，精神和运动正常，牙齿有白垩现象，尿液和粪便颜色均正常；氟加低钙组大鼠在饲养末期生长缓慢，运动正常，但会出现嗜睡现象，毛发杂乱，尿液较少，粪便颜色出现淡灰白色；氟加高钙组大鼠生长缓慢，不喜饮水，进食减少，运动减少，毛色无光泽，且尿液量极少，出现浑浊，粪便质地较硬，呈灰白色。

2.2 肾脏相关生化指标

如表2所示，30 d时，各组指标变化不显著。60 d时，与对照组相比，BUN、CRE、UA水平升高(P< 0.05)；与氟组相比，氟 + 1% 钙组中BUN水平降低，CRE和UA水平显著降低(P< 0.05)。90 d时，与对照组相比，肾脏损伤严重，氟组BUN、CRE、UA水平显著升高(P< 0.05，P< 0.01)；与氟组相比，氟加钙组损伤均有一定的缓解，氟 + 0.5% 钙组和氟 + 1% 钙组中BUN、CRE、UA水平均发生显著降低(P< 0.05，P< 0.01)

2.3 肾脏HE染色

从图1中可以看出，对照组肾脏结构正常，肾小球充盈且间隙均匀；氟组大鼠肾脏结构结构发生明显改变，肾小球发生萎缩，间隙增大，细胞排列紊乱，肾细胞结构受损；氟 + 0.5 % 钙组中虽然有一定程度的好转，但是肾脏结构损害现象依然很明显；在氟 + 1 % 钙组中，肾小球形态逐渐恢复正常，肾细胞排列逐渐规整，细胞间隙减小，肾脏的形态结构有很明显的改善。

表2 不同周期大鼠肾脏相关指标变化

2.4 肾脏相关凋亡蛋白免疫组化

肾脏中凋亡蛋白Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3的表达如图2所示。从表3的分析结果可以得出，与对照组相比，氟组肾细胞凋亡增强，Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表达均发生显著增强(P< 0.05，P< 0.01)；与氟组相比，在氟 + 0.5% 钙组和氟 + 1% 钙组中，以上蛋白的表达均显著性降低(P< 0.05，P< 0.01)，肾细胞凋亡程度降低。

表3 肾脏中Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表达统计结果

3 讨论与结论

氟中毒的危害已经蔓延全球，且具有难以治愈、被侵害器官多、机体受损时间较长等特点。氟中毒的治疗已经成为人们日常关注的重点，使用钙对氟中毒进行治疗引起了广泛的关注。

肾脏具有维持内环境激素分泌、调节血压、物质传送等功能，一方面可以维持体内电解质和酸碱平衡，另一方面可以运输有害物质排出体外。其中肾脏的生化功能指标和形态结构是反映肾脏是否可正常行使功能的重要方面。氟中毒高发地区人体的肾脏功能指标检测报告称肾小球的滤过率发生明显恶化，尿素氮、肌酐等指标水平均发生显著升高[9]，另有报道发现，慢性暴露于高氟环境的大鼠肾脏功能发生损害，肾小球排列紊乱，形状不规整，且有大量的炎症细胞浸润，且指标尿酸、碱性磷酸酶等水平发生升高[10]。在本实验结果中同样发现氟中毒使得肾脏的结构遭到损害，生化功能指标BUN、CRE、UA也发生显著升高，肾功能受损，但是在补充钙后肾脏的结构形态逐渐恢复，细胞排列变得整齐，且生化指标BUN、CRE、UA水平发生明显好转，可以看出钙可缓解由氟中毒带来的肾脏损伤和功能下降。

细胞凋亡被称作为细胞的程序性死亡，是细胞体内由基因控制的一种生命进程[11]。氟中毒会导致机体的多种组织器官均会发生凋亡现象， Caspase8、Caspase3蛋白表达发生明显增强，占凋亡发生的主导地位[12]。Fas和Fas-L系统是近年来在细胞凋亡领域研究较为深入的一类分子，它也是具有促进凋亡发生的神经类生长因子受体[13]。有研究指出机体在发生氟中毒时，Fas和Fas-L在发生凋亡的睾丸细胞和牙龈成纤维细胞凋亡过程中显着增加，同时激活Caspase8和Caspase3[14～15]。与此类似，在本实验中，氟组大鼠的肾脏Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表达均增强，表明肾脏细胞发生了凋亡，但是在加钙组中，它们的表达量均下降，肾细胞凋亡受到抑制，表明钙可一定程度缓解由氟中毒导致的肾脏凋亡，体现钙对缓解氟中毒的优势作用。

总之，氟中毒会造成肾脏的损伤和凋亡，在补充营养物质钙后，会很好的缓解由氟中毒导致的肾脏损伤和凋亡，其中，添加1% 钙含量效果甚佳。