血清miR-221、miR-193a-5p与卵巢上皮癌患者临床病理特征和预后的关系

李军 韩玲 董力 刘书磊

卵巢上皮癌是女性生殖系统常见的肿瘤之一，是全世界死亡率最高的妇科恶性肿瘤，在女性癌症死亡原因中排第四位[1]。卵巢上皮癌占卵巢恶性肿瘤85%～90%，最为常见，由于卵巢上皮癌在发病早期没有特殊症状，因此大多数患者被发现时已经处于癌症晚期或者已经发生转移，因此具有较高的死亡率[2,3]。微小核糖核酸(microRNA，miR)是一种长度为20～22个核苷酸序列的调节性非编码RNA调节分子，主要通过与目的mRNA相互作用来调控转录后基因的表达[4]，广泛存在于真核生物中，其主要参与人类将近1/3的基因表达调控[5]。miR-221在多种肿瘤中均存在异常表达，有研究表明miR-221在肝癌[6]、结肠癌[7]、卵巢癌[8]等多种癌症中均高表达；miR-221能够通过靶向p57、p27等相关因子的表达来调控前列腺癌的细胞周期[9]。有研究表明miR-193a-5p在膀胱癌[10]、食管鳞状细胞癌[11]、非小细胞肺癌[12]等癌症中均存在异常表达。本研究主要通过检测卵巢上皮癌患者血清中miR-221、miR-193a-5p的表达水平，并分析miR-221和miR-193a-5p与患者的预后和临床病理参数之间的关系，为卵巢上皮癌的诊断和治疗提供参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年5月至2015年7月西宁市第二人民医院收治的97例卵巢上皮癌患者(卵巢上皮癌组)，同期收集97例健康志愿者作为对照组。本研究中97例卵巢上皮癌患者，年龄36～73岁；<60岁58例，≥60岁39例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期74例；低分化患者41例，中高分化患者56例；肿瘤大小：<2 cm患者48例，≥2 cm患者49例；淋巴结转移患者52例，无淋巴结转移患者45例。本研究通过西宁市第二人民医院伦理委员会审核同意。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：所有卵巢上皮癌患者的诊断以病理组织学诊断为依据，且患者均未接受过放疗或者化疗，临床资料齐全，患者签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：排除其他部位肿瘤、内分泌疾病、高血压等疾病以及近期进行手术治疗的患者；随访资料不完整。

1.3 试剂与仪器 miR-221和miR-193a-5p以及内参引物均由上海捷瑞生物有限公司合成；RNA逆转录试剂盒和RT-qPCR试剂盒均购于诺唯赞生物有限公司；主要仪器：美国ABI7500荧光定量PCR仪，美国Thermo公司离心机，美国Thermo公司-80oC冰箱。

1.4 样本采集及检测 健康志愿者于体检当日采集空腹静脉血5 ml，卵巢上皮癌患者于住院次日采集空腹静脉血5 ml均放至促凝管中，温度4℃，1 600 r/min离心10 min，取上清进行分装标记，-80℃冰箱保存备用。

1.5 总RNA的提取及实时荧光定量PCR Trizol试剂提取患者血清中的总RNA。逆转录试剂盒(TaKaRa)对mRNA进行逆转录。运用SYBR Green(TaKaRa)试剂盒进行实时荧光定量PCR。反应条件为：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s，共40个循环。U6正向引物：5’-CTT CGG CAG CAC ATA TAC T-3’，U6反向引物5’-AAA ATA TGG AAC GCT TCA CG-3’；miR-221正向引物：5’-CAG CAT ACA TGA TTC CTT GTG A-3’，miR-221反向引物5’-CTT TGC TGT TTG AGA TGT TTG G-3’；miR-193a-5p正向引物：5’-TGG GTC TTT GCG GGC-3’，miR-193a-5p反向引物5’-GAA TAC CTC GGA CCC TGC-3’。反应结束后应用仪器配套软件进行Ct值计算，与内参U6Ct值进行比值计算miR-221和miR-193a-5p的相对表达量。所有实验均重复3次。

1.6 随访 通过电话或者门诊复查的方式对患者进行随访，2～3个月随访1次，随访时间为患者确诊后1～60个月，患者死亡停止随访。

2 结果

2.1 2组血清miR-221、miR-193a-5p表达水平比较 卵巢上皮癌组血清中miR-221、miR-193a-5p相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组血清miR-221、miR-193a-5p表达水平比较

2.2 卵巢上皮癌患者血清miR-221、miR-193a-5p表达水平与临床病理特征的关系 卵巢上皮癌患者血清中miR-221的表达水平与临床分期有关(P<0.05)，而与患者年龄、肿瘤大小、分化程度和淋巴结转移无关(P>0.05)；miR-193a-5p表达水平与淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者年龄、临床分期、肿瘤大小、分化程度无关(P>0.05)。见表2。

表2 卵巢上皮癌血清中miR-221和miR-193a-5p表达与临床病理特征的关系

2.3 卵巢上皮癌患者血清miR-221、miR-193a-5p水平与患者预后的关系

2.3.1 单因素分析miR-221对预后的影响：以中位数为界，将卵巢上皮癌患者分为miR-221高表达组(n=49例)和miR-221低表达组(n=48例)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，miR-221高表达组与低表达组术后5年生存率分别为26.53%(13/49)、33.33%(16/48)，术后生存时间分别为(29.74±1.98)个月、(34.83±2.12)个月，2组间差异有统计学意义(Log Rank 2=-13.110，P=0.000)。见图1。

图1 血清miR-221水平对卵巢上皮癌预后的影响

2.3.2 单因素分析miR-193a-5p对预后的影响：以中位数为界，将卵巢上皮癌患者分为miR-193a-5p高表达组(n=49例)和miR-193a-5p低表达组(n=48例)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，miR-193a-5p高表达组与低表达组的术后5年生存率分别为20.41%(10/49)、31.25%(15/48)，术后生存时间分别为(25.57±1.90)个月、(32.90±2.06)个月，差异有统计学意义(Log Rank 2=-18.205，P=0.000)。见图2。

2.4 血清miR-221、miR-193a-5p联合检测对卵巢上皮癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，miR-221、miR-193a-5p的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.824、0.801。血清miR-221、miR-193a-5p联合检测具有较好的卵巢上皮癌诊断价值，联合应用的敏感度、特异度分别为0.810、0.843。

图2 血清miR-193a-5p水平对卵巢上皮癌预后的影响

3 讨论

卵巢上皮癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，具有较高的死亡率和较低的5年生存率，由于缺乏早期、安全和非侵入性检测方法，加之卵巢上皮癌患者在发病早期没有明显症状，因此，大部分患者被发现时已经处于癌症晚期[2,3]。因此，寻找卵巢上皮癌的肿瘤生物标志物，为卵巢上皮癌提供早期的诊断依据成为当今研究的重中之重[13,14]。研究表明miRNA在肿瘤的发生和发展的过程中发挥重要的作用，众多miRNA能够作为多种癌症诊断和预后判断的生物指标[15,16]。在卵巢上皮癌中，血清中的miRNA对于癌症的判断具有重要的临床意义，如miR-17-5p、miR-221-5p、miR-23a在卵巢上皮癌的诊断中发挥重要的价值[17]。因此，寻找特异性的卵巢上皮癌的诊断和预后标志物，能够为卵巢上皮癌的诊断和检测提供新的潜在分子标志物。

miRNA是近年来研究发现的一类调节性的非编码RNA分子，miRNA主要在转录后调控基因的表达，miRNA与细胞的增殖分化、凋亡等有关[4,5]。miR-221参与调控一系列生物活动，如血管生成、细胞增长和凋亡等，其在肝癌、胰腺癌、卵巢上皮癌、卵巢癌等癌症的发生和发展中发挥重要作用[18,19]；miR-221可以通过对GHR、PUMA、Bmf、DDIT4等癌基因的调控来影响细胞的增殖分化和凋亡，进而影响肿瘤的发生发展[9,20]。有研究发现miR-193a-5p在胃癌组织中表现为低表达，可以作为胃癌诊断的潜在生物标志物[21]；有报道miR-193a-5p在非小细胞肺癌、膀胱癌、食管鳞状细胞癌等癌症中均存在异常表达[10-12]，同时miR-193a-5p在一组被诊断为慢性髓系白血病的南非患者中亦存在表达[22]。

本研究结果显示，和健康志愿者对比，miR-221和miR-193a-5p在卵巢上皮癌患者血清中的表达水平升高。通过对卵巢上皮癌患者的临床参数进行对比分析，结果表明卵巢上皮癌患者miR-221血清表达水平与临床分期有关，而与患者年龄、肿瘤大小、分化程度和淋巴结转移无关。在卵巢上皮癌中miR-221出现高表达时，患者具有较晚的临床分期，表明miR-221在卵巢上皮癌的发生和发展过程中可能发挥促癌作用。同时预后结果显示，miR-221高表达的患者具有较差的预后和术后生存率，可以作为卵巢上皮癌患者预后判断的一项指标。血清miR-193a-5p的表达水平与淋巴结转移相关，而与患者年龄、临床分期、肿瘤大小、分化程度无关。在卵巢上皮癌中，当miR-193a-5p高表达时，患者有明显的淋巴结转移，表明miR-193a-5p也主要发挥促癌作用。同时预后结果显示，miR-193a-5p高表达的患者具有较差的预后和术后生存率，同样可作为卵巢上皮癌患者预后判断的一项指标。

通过ROC曲线结果，发现miR-221、miR-193a-5p的AUC分别为0.824、0.801，二者表达水平均有助于对卵巢上皮癌患者和健康志愿者进行区分，二者可以作为卵巢上皮癌患者和健康志愿者的潜在鉴别指标。血清miR-221、miR-193a-5p联合检测后对卵巢上皮癌诊断的灵敏度和特异度分别为81.0%和84.3%，与二者自身相比均明显增高。因此，联合检测卵巢上皮癌血清中miR-221、miR-193a-5p表达水平可作为卵巢上皮癌诊断的潜在有效的生物学指标。

综上所述，miR-221、miR-193a-5p在卵巢上皮癌的发生和发展过程中主要发挥促癌的作用，联合检测血清miR-221、miR-193a-5p有助于卵巢上皮癌患者的诊断和预后评估，为血清miRNAs在卵巢上皮癌中的诊断应用提供了一定的依据。