细胞焦亡在急性胰腺炎发病机制中的作用

韦碧薇， 龚雅慧， 梁志海

广西医科大学第一附属医院 消化内科一病区， 南宁 530021

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应，其发病率逐年增加，发生率也随年龄的增长而增加[1]。20%～30%的AP患者可进展为重症急性胰腺炎(server acute pancreatitis, SAP)，SAP的病死率高达30%[2]。传统的“酶异常激活”和“自身消化学说”未能完全阐明AP的发病机制。目前的研究认为炎性因子反应、微循环障碍、氧化应激反应、肠道细菌移位等均参与了AP的发病过程。随着研究的深入，发现胰腺腺泡细胞损伤和死亡方式决定了AP的进展和预后，因此了解AP发病早期胰腺腺泡细胞死亡方式可对发病机制、诊断和治疗提供新的理论基础。细胞凋亡和坏死是AP中胰腺腺泡细胞两种主要的死亡方式，在病理刺激下胰腺腺泡细胞从坏死向凋亡转变可以降低AP的严重程度，产生有利影响[3]。除这两种细胞死亡方式外，新近的研究表明，细胞焦亡与AP的发生发展亦密切相关，细胞焦亡作为其中一种可促炎性反应的细胞死亡方式，是依赖于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)活性的细胞程序性死亡。目前大量研究[4-6]证实，细胞焦亡参与了感染性疾病、免疫性疾病、肿瘤等诸多疾病的发生，并发挥重要作用。细胞焦亡通过活化核因子-κB(NF-κB)通路诱导炎性小体激活，以及切割GSDMD(gasdermin D)释放效应分子，引起急性炎症反应[7]。炎性小体的激活和释放效应分子对AP的全身免疫应答和适应性免疫系统的激活至关重要，是AP中胰腺及胰腺外器官损伤的重要决定因素[8-9]。本文就细胞焦亡在AP发病机制中的作用研究进展作一综述。

1 细胞焦亡与AP发病机制的关系

细胞焦亡不同于细胞凋亡、自噬、坏死等其他细胞死亡方式，焦亡需要炎症性的Caspase参与。细胞焦亡时，细胞发生肿胀，细胞上形成气泡状突出物，膜上形成众多1～2 nm孔隙，随后细胞膜发生破裂，大量胞质内容物释放，诱发炎症反应，形态学上出现细胞核浓缩，DNA断裂等改变[10-11]。细胞焦亡在生理上可以清除细胞内病原体，抵御病原体感染，保护机体[12]；还可以通过快速的质膜破裂将细胞内的病原体驱逐并暴露于细胞外，成为免疫效应机制的目标。同时，焦亡可使受感染细胞释放出炎性细胞因子和危险信号，将更多的免疫细胞吸引至感染部位，从而有助于消灭病原体，维持机体免疫平衡。但是，与过度炎症反应相似，当过多的宿主细胞发生焦亡时，则可能由于细胞内炎性因子的过度释放或宿主细胞的过度破坏而对机体产生有害影响[13]，导致疾病加重。细胞焦亡激活通路可分为依赖Caspase-1的经典途径与依赖Caspase-4/5/11的非经典途径。

1.1 细胞焦亡的激活机制 细胞焦亡的经典途径依赖于Caspase-1，通过细胞膜表面的模式识别受体识别病原体相关分子模式或损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMP)后，在接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)的胱天蛋白酶募集域(Caspase recruitment domain, CARD)的相互作用下组装和激活炎性小体，募集Caspase-1前体(pro-Caspase-1)[13]，继而促进Caspase-1的活化并释放。活化的Caspase-1将IL-1β前体和IL-18前体转化为成熟的IL-1β和IL-18[14]。Caspase-1还可以切割GSDMD，分泌到细胞外，募集更多的炎症细胞，扩大炎症反应。

除了上述经典途径，不依赖于Caspase-1的非经典途径同样发挥着重要作用。鼠源性Caspase-11和人源性Caspase-4/5是同源蛋白，Caspase-11直接识别脂多糖，通过Caspase-11的CARD与脂多糖结合后，促使其寡聚和活化[15]。活化的Caspase-11也可以切割GSDMD，形成具有打孔功能的N端，使细胞破裂，诱导细胞焦亡。同时Caspase-11通过间接参与NOD样受体蛋白3(nod-like-receptor protein 3, NLRP3)炎性小体的形成进而诱导pro-Caspase-1激活，促进促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的成熟[14]。这种依赖于Caspase-4/5/11的细胞焦亡方式称为非经典细胞焦亡途径。

1.2 细胞焦亡的关键蛋白——GSDMD GSDMD是gasdermin家族的胞浆蛋白，由487个氨基酸构成，全长53 kD，可广泛表达于各种组织与细胞[16]。GSDMD作为Caspase-1/4/5/11的共同底物，是细胞焦亡中的执行者。

经典或非经典途径中的Caspase-1/4/5/11在Asp276位点上对GSDMD进行切割，裂解后的GSDMD释放出2个结构域，即gasdermin-N和gasdermin-C。N端片段与质膜相结合，在质膜上形成10～15 nm的gasdermin孔隙。这些孔隙的形成被认为是细胞膜上电化学梯度改变所造成，导致无法维持细胞渗透压平衡和稳定细胞体积，最终造成细胞破裂[17]，但值得关注的是，即使在没有发生细胞裂解的情况下，巨噬细胞和树突状细胞亦能够以GSDMD依赖的方式释放IL-1β和IL-18[18]。

1.3 细胞焦亡在AP发病机制中的作用 Caspase-1和Caspase-11的激活可促进AP炎症反应并加重胰腺损伤。Rau等[19]对AP大鼠模型注射Caspase-1抑制剂后，发现在AP发病早期IL-1β水平、胰腺坏死程度以及病死率均显著降低。在巨噬细胞中，当内质网功能严重受损引起内质网应激时，活化的内质网源性转录因子(C/EBP-homologous protein, CHOP)使pro-Caspase-11发生自身溶解，诱导Caspase-11和IL-1β激活，CHOP-Caspase-11通路在动物实验[20]中也被认为参与了AP的发病机制。此外，有研究[21]指出，敲除Caspase-1与Caspase-11的小鼠较敲除NLRP3或ASC的小鼠对AP有更好的保护作用，这可能与相关的细胞焦亡途径被抑制后，胰腺腺泡细胞破坏、促炎细胞因子释放减少有关。

2 细胞焦亡的相关分子与AP发病机制的关系

2.1 炎性小体与AP 大部分炎性小体是由NOD样受体或黑色素瘤缺乏因子2样受体蛋白家族、ASC、pro-Caspase-1结合组成的多蛋白复合体。炎性小体可以识别来自宿主细胞胞质的威胁，是检测细胞内抗原和DAMP的传感器。其组装激活后募集pro-Caspase-1，将其裂解成Caspase-1[22]，并将信号传导给下游GSDMD蛋白，最终实现细胞焦亡。因此，细胞焦亡的过程中需要炎性小体参与，炎性小体的激活是细胞发生焦亡的关键。与细胞焦亡相关的炎性小体主要包括NLRP1、NLPR3、NLRC4、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma, AIM2)和Pyrin[23]。目前发现与AP发病机制有关的炎性小体主要是NLRP3和AIM2。

2.1.1 NOD样受体蛋白3(NLRP3) NLRP3属于NOD受体蛋白家族，NLRP3炎性小体由NLRP3蛋白、ASC和pro-Caspase-1组成。当AP发生时，胰蛋白酶激活后引起胰腺腺泡细胞自身消化[24]，免疫细胞中Toll样受体(TLR)4和TLR9以及胰腺腺泡细胞中NOD1可以识别坏死腺泡细胞释放的三磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和游离脂肪酸在内的多种刺激，通过受体P2X7激活NLRP3炎性小体[25-26]。缺乏P2X7基因可以减少AP动物模型的胰腺损伤和炎症反应[21]。另一方面，在应激条件下，机体生成活性氧(ROS)增加，硫氧还蛋白互作蛋白与NLRP3结合，促进炎性小体的激活[27-28]。Ren等[29]研究证明，胰腺腺泡细胞内的ROS会加重AP严重程度，清除ROS时能减少NLRP3炎性小体的激活，进而减轻胰腺损伤。除胰腺自身损伤外，NLRP3炎性小体还参与了胰外脏器的损伤机制[30]。Jin等[31]研究发现通过减少ROS的产生和抑制NLRP3炎性小体的激活，可以减轻胰腺和肺损伤的严重程度。Xu等[32]在SAP大鼠模型中，还发现NLRP3可能通过Caspase-1途径参与了肠损伤，导致肠屏障功能受损。

2.1.2 黑色素瘤缺乏因子2(AIM2) AIM2的C端HIN200结构域可以识别病毒DNA和细菌双链DNA，与ASC结合形成AIM2/ASC/pro-Caspase-1复合体，即AIM2炎性小体。临床研究表明，AP患者的全身炎症状态与外周血单个核细胞介导的AIM2表达及AIM2介导的IL-1β产生存在相关性。在AP早期过程中AIM2炎性小体的激活和表达增加，提示AIM2的激活不仅可以促进局部胰腺炎症，也可以促进AP全身性炎症和多器官衰竭[33]。然而AIM2在AP发病过程中的机制尚未阐明，有研究[34]发现可能与核小体有关。因为胰腺损伤后可释放出核小体，它是由DNA和组蛋白组成的复合物，是感染和无菌性炎症环境中常见的疾病预后标志物，其可导致机体全身炎症反应加重。另外，体外研究[35]还发现晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation endproducts, RAGE)在调节核小体复合物中DNA/高迁移率组蛋白1(high mobility group box1, HMGB1)的摄取方面起着重要作用：核小体激活RAGE后，使双链RNA依赖蛋白激酶磷酸化，通过核小体-RAGE-AIM2炎性小体通路，激活AIM2炎性小体和释放促炎因子IL-1β、HMGB1来促进AP发展。

2.2 效应分子与AP 细胞焦亡发生后，细胞释放出的效应分子主要为IL-1β和IL-18，二者均是典型的IL-1家族成员。IL-1是驱动炎症反应的主要因素，可引起发热，激活免疫细胞，发挥抗微生物和促炎作用。IL-1在感染环境中起保护性作用，但当它以不受控制的方式产生时，会导致各种自身炎症性疾病发生病理变化[36]。IL-1β被认为是AP无菌性炎症和损伤反应的主要决定因素。IL-1β受体拮抗剂对IL-1β信号的抑制可减少胰腺炎症和胰腺组织损伤[37]。IL-18参与辅助性T淋巴细胞(Th)1和Th2免疫反应，并参与自然杀伤细胞和巨噬细胞的活化，在不同的病理中发挥一定的作用。IL-18可诱导IFNγ的产生，而IFNγ是抗病毒和抗菌免疫的重要介质。与IL-1β类似，IL-18也可促进与IFNγ相关的疾病发生病理变化[38]。血清IL-18水平与AP的严重程度密切相关，可以作为早期潜在的预测指标。此外，IL-18升高通过激活Th2反应加重AP，并参与AP相关的肺损伤[39]。

另一方面，细胞焦亡的关键蛋白GSDMD除了影响细胞焦亡、释放IL外，还可以促使细胞释放HMGB1。有研究[21,40]表明HMGB1作为主要内源性TLR4配体，分别通过TLR4和核酸TLR(如TLR9)诱导和增强AP的无菌性炎症反应，抑制HMGB1的释放或细胞因子活性，也可对AP动物模型产生保护作用。在AP患者中，血清HMGB1水平显著升高，并与疾病的严重程度呈正相关[41]。

以上细胞焦亡的相关分子，包括促炎因子IL-1β、IL-18和HMGB1，它们与AP炎症反应程度、胰腺实质细胞损伤和疾病进程均密切相关。

3 小结与展望

细胞焦亡是受多基因调控的细胞程序性死亡，在免疫和疾病中起着重要作用。经典途径和非经典途径分别通过Caspase-1和Caspase-4/5/11介导激活，切割下游关键蛋白GSDMD，诱导细胞焦亡。细胞焦亡与代谢物受体、炎性小体激活、炎性因子之间的多种联系密不可分，既往研究已经表明这些激活途径及其发生过程中释放的分子与AP发病机制密切相关。但是，仍有许多细胞焦亡的相关机制需要进一步探索，如：除NLRP3、AIM2以外其他NOD样受体与AP的关系、溶酶体破坏激活NLRP3炎性小体途径与AP的关系、胰腺内溶酶体降解等防御机制是否能有效对抗坏死作用、代谢物受体能否通过细胞焦亡通路抑制AP的组织损伤等。进一步探究细胞焦亡的调控机制，可能为AP的治疗提供新的靶点和理论依据。