洁净室内新风系统微生物多样性分析

卢英

山东齐都药业有限公司 山东临淄 255400

1 材料与方法

1.1 材料

某化验室药厂，截至2018 年11 月31 日使用了不同时间的新风系统中的超细玻璃纤维空气滤膜，分为3 个样本组，每个样本组含有3 个重复样本（表1）。所有样本装入无菌采样袋中，在4℃条件下运输至实验室，4h 内处理。

表1 不同使用时间的空气滤膜样本编号

1.2 样本处理

①每个样本取15-20 片空气滤膜剪碎，分装入含有0.9% 生理盐水的50mL 无菌离心管中，40C，200g 离心2h；②轻轻涡旋，用0.22μmMCE 微孔滤膜过滤；③收集微孔滤膜，剪碎后用于提取样本的宏基因组DNA[1]。

1.3 16SrDNA 扩增子测序

各样本的宏基因组DNA 用无菌水稀释至终浓度1ng/μL， 并 以此为模板， 利用16SV3-V4 区 通 用 引物进行PCR扩增。PCR 产物经过琼脂糖凝胶电泳检测并回收后， 使用IonPlusFragmentLibraryKit48rxns 建库试剂盒构建宏基因组文库，经过定量和检测后进行高通量测序，测序方法为单端测序法。

1.4 测序数据处理

使用Cutadaptv1.9.1 先对reads 进行初步处理得到原始数据，然后进行去除嵌合体序列的处理，得到有效数据。利用Uparsev7.0.1001 对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97% 的一致性将序列聚类成为操作分类单元，同时会选取OTU 的代表性序列，依据其算法原则，筛选OTU 中出现频数最高的序列作为代表序列；对OTU 序列进行物种注释，用Mothur 方法与SILVA132 的SSUrRNA 数据库进行物种注释分析，获得分类学信息并分别在各个分类水平。

2 结果与讨论

2.1 测序数据分析

16SrDNA 扩增子测序得到的有效数据数目在45878-64178范围内，平均长度395-415nt，有效数据中碱基质量值大于20 的碱基所占的百分比超过82%，数据得率90% 以上[2]。

2.2 OTLs 聚类分析

在97% 相似性水平上进行聚类，3 个样本组共有OTU 数量达1015 个，样本组JN6JN9 和JN12 特有的OTU 数量分别为303484 和274 个。基于OTU 的物种分类分析，细菌种类覆盖31个门725 个属。其中，样本组JN9 中特有的OTU 数目最多，预示含有较多的特有微生物种类。

2.3 门水平Top10 物种相对丰度及优势物种差异分析

对OTU 的代表序列进行物种注释，根据物种注释结果，选取3 个样本组在门分类水平上最大丰度排名前10 的物种进行物种相对丰度和优势物种差异分析，结果显示各样本中以金黄色葡萄球菌（占比27%-54%）、大肠埃希菌（占比13%-30%）、铜绿假单孢杆菌（占比12%-30%）和枯草杆菌（占比4% 一10%）的微生物居多，4 种细菌门总丰度平均为90%。许多对人体有害的微生物如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌等都属于这些种类。在生活环境中，金黄色葡萄球菌细菌比较常见，即使经过消毒杀菌，其再生能力仍然较强。大肠埃希菌细菌即使处于一些抗生素环境中也具有较强的生命力。放线菌中绝大多数是有益菌，也有极少数会引起人类的疾病。枯草杆菌的一些细菌可以释放细胞神经毒素从而使人体发生炎症性神经变性，甚至己经可以作为某些环境下的污染指标[3-4]。

3 结语

采用高通量测序技术对样本16SrDNA 片段进行测序，可以获得准确的序列信息和更大的数据量，从而在后续分析中获得更加深人、全面和可靠的结果。将此技术引人室内空气净化系统的细菌多样性分析中，可以提供更加详实准确的信息。通过分析化验室药厂室内新风净化系统随着使用时间的延长室内空气中微生物群落结构的变化，发现该地区室内空气中微生物含量较丰富，群落结构长期变化不大，并且空气中存在条件致病菌，如奥斯陆莫拉氏菌等。该地区室内新风空气净化系统使用12 个月时存在一定的微生物二次污染风险。