HPV mRNA、DNA检测对宫颈细胞学ASCUS分流诊断价值的Meta分析

陆璐，余慧萍，成建

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一。宫颈脱落细胞的细胞学检查在宫颈癌筛查中至关重要，是目前国内外宫颈癌筛查指南中不可或缺的方法。未明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS）是伯塞斯达系统（TBS）分类法中最常见的细胞学病变描述，其细胞改变程度较反应性改变细胞明显，且有进展为宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅱ级或Ⅲ级等高度鳞状上皮内病变的可能［1］,故对ASCUS 患者进行及时有效地评价和分流管理，有利于患者的诊治和预后。

2016 年美国妇产科医师学会推荐的宫颈癌筛查及预防指南建议将高危型人乳头瘤病毒（HPV）DNA检测结果作为ASCUS人群主要的分流依据，即HPV DNA 阳性者行阴道镜检查［2］。但是，由于HPV感染具有一过性的特点，单纯HPV DNA检测可能出现假阳性结果，造成长期过密的随访和不必要的阴道镜检查。HPV E6/E7 mRNA检测是近年来兴起的一种新型检测技术，可以检测高危型HPV E6/E7 癌基因的mRNA表达情况。该检测方法能较好地反映癌基因的活动度，更好地预测宫颈病变的风险［3］，因此逐渐应用于临床宫颈癌筛查。目前已有较多研究对HPV E6/E7 mRNA 与HPV DNA 检测技术在宫颈癌筛查中的诊断准确性进行对比分析，但针对两者在ASCUS人群分流中应用价值的比较研究尚少见。本研究对关于HPV E6/E7 mRNA 与HPV DNA 检测对ASCUS人群分流价值的诊断研究进行Meta分析，以期为临床优化ASCUS 患者的分流处理提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：（1）国内外公开发表的关于HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA检测对ASCUS人群分流价值的诊断研究。（2）研究中有宫颈HPV E6/E7 mRNA 与HPV DNA 检测的结果。（3）以病理组织学诊断为金标准。（4）有完整的原始数据，能直接或间接获得筛查试验的真阳性值（TP）、假阳性值（FP）、假阴性值（FN）、真阴性值（TN）。排除标准：（1）样本量≤60例。（2）无病理结果。（3）数据不完整、不能获得完整资料的文献。（4）综述、重复报道、会议内容等。

1.2 文献检索策略 采用主题词和自由词相结合的方式，分别以宫颈、人乳头瘤病毒、未明确诊断意义的非典型鳞状上皮 细 胞、HPV、mRNA 为 中 文 检 索词，以cervical、human papillomavirus、HPV、mRNA、E6/E7、ASCUS为英文检索词，检索MEDLINE、EMbase、Cochrane Library、Web of Science、万方数据库、维普数据库和中国知网（CNKI）等数据库，并采用文献追溯等方法搜集关于HPV E6/E7 mRNA 与HPV DNA 检测对ASCUS 人群分流诊断价值的研究。语言限制为中、英文。检索时限为2010年1月1日—2019年12月31日。

1.3 文献筛选及数据提取 由2 位研究者分别独立根据纳入与排除标准筛选文献。首先，阅读文题和摘要，剔除重复、不符合纳入与排除标准的文献，对于部分重复发表或数据有重叠现象的文献，选取样本量最大、最近发表或信息最详细者；其次，对可能纳入的文献进一步阅读全文并交叉核对结果；最后，对存在异议的文献，则研究小组讨论决定是否纳入。对纳入文献提取以下数据资料：（1）研究的基本信息，包括第一作者、发表时间、国家等。（2）研究对象的基本特征，包括样本量、年龄等；HPV mRNA和HPV DNA检测选用试剂盒的检测原理，如HPV mRNA 检测选用PreTect HPV-Proofer、APTIMATM等试剂盒检测原理；HPV DNA 检测选用第二代杂交捕获法（Hybrid Capture 2，HCⅡ）或PCR 反向杂交等原理。（3）偏倚风险评价的关键要素，包括病例选择（Patient Selection）、待评价试验（Index Test）、金标准（Reference Standard）及病例流程和进展情况（Flow and Timing）4个部分。（4）实验原始数据，直接获取或计算得出TP、FP、FN、TN。

1.4 纳入研究的偏倚风险评价 采用RevMan 5.3 软件中的诊断性试验准确性质量评价工具-2（QUADAS-2）对纳入研究进行偏倚风险评价。由2名评价者根据标准独立评价，如遇分歧，则研究小组讨论协商。

1.5 统计学方法 采用Meta-Disc 1.4软件检测异质性，包括阈值效应和非阈值效应引起的异质性及异质性来源。采用敏感度对数与（1-特异度）对数的Spearman 相关系数检验是否存在阈值效应，P≥0.05表示不存在阈值效应。以诊断比值比（DOR）为效应量，对不同检测方法的DOR 进行Cochrane-Q 检验，检测水准α=0.1，同时结合I2判断异质性大小。当P＞0.1和I2≤50%，无异质性，采用固定效应模型进行Meta 分析；当P≤0.1或I2＞50%，存在异质性，则进一步分析异质性来源，采用随机效应模型进行Meta 分析。计算HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA检测合并的敏感度（SEN）、特异度（SPE）、阳性似然比（PLR）、阴性似然比（NLR）及其95%CI。采用线性模型拟合受试者工作特征（SROC）曲线，计算曲线下面积（AUC），AUC 越接近1，认为诊断价值越高。采用Stata 12.1软件，以Egger线性回归法对纳入文献进行偏倚检测，采用标准正态离差（standard normal deviate，SND）对效应估计值的精确度（precision）作回归分析。SND 的定义为OR与其标准误（SE）的比值，精确度的定义为SE的倒数。P＞0.05提示不存在发表偏倚。

2 结果

2.1 文献筛选流程及结果 初检出相关文献1 536篇。经剔除重复文献，阅读摘要及全文后，按照纳入、排除标准进一步筛选，最终纳入文献15篇，包括ASCUS患者4 019例。文献筛选流程及结果见图1。纳入研究的基本特征见表1。

Fig.1 Flow diagram of screening articles图1 文献筛选流程图

2.2 所纳入的研究偏倚风险评价结果 15 项研究均说明了纳入研究对象的条件，其中5 项未能避免不恰当的排除；15项研究均对研究对象进行宫颈活检，7项研究采用了盲法，具有可靠的金标准；6项研究描述了初步筛查与阴道镜活检的时间间隔。各研究的偏倚风险评价结果见图2。

2.3 异质性分析结果 HPV E6/E7 mRNA 与HPV DNA 检测的Spearman 相关系数rs分别为0.222（P=0.427）和0.466（P=0.080），提示不存在阈值效应。Q检验显示，研究人群中HPV mRNA检测的Cochrane-Q 为23.610，P=0.051，I2=40.7%；HPV DNA 检测的Cochrane-Q 为28.570，P=0.012，I2=51.0%，提示各研究结果间存在统计学异质性。

Fig.2 Risk assessment of bias in included studies图2 纳入研究的偏倚风险评价

Tab.1 The basic characteristics of included studies表1 纳入文献的的基本研究特征

2.4 亚组分析与Meta 回归分析结果 将HPV E6/E7 mRNA 检测和HPV DNA 检测分别按样本量、检测原理进行亚组分析。结果显示，HPV E6/E7 mRNA 检测研究间的异质性可能与检测原理有关，HPV E6/E7 mRNA 检测和HPV DNA 检测研究间的异质性可能与样本量有关，见表2。Meta 回归分析结果显示，2种检测方法异质性来源与以上2种变量无明显相关性（均P＞0.05），见表3。

2.5 Meta 分析结果 异质性分析结果显示，HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 各研究结果间存在统计学异质性（I2分别为40.7%、51.0%，均P≤0.01），经异质性分析处理后，仍无法消除，故选择随机效应模型合并统计量。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 在ASCUS人群检出CINⅡ+合并的SEN、SPE、PLR、NLR 及其95%CI见表4，其诊断比值比的Meta 分析结果见图3、4。建立汇总受试者SROC 曲线，2 种检测方法检出CINⅡ+的AUC 分别为0.847 和0.760，见图5、6。结果显示，除SEN 外，HPV E6/E7 mRNA 检测在ASCUS 人群检出CINⅡ+的宫颈病变的诊断效能优于HPV DNA检测。

2.6 发表偏倚评估 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA各研究均不存在明显的发表偏倚（P分别为0.134和0.163），见图7。

Tab.2 Subgroup analysis results of included studies表2 纳入研究异质性的亚组分析结果

Tab.3 Meta regression analysis results of two detection methods表3 2种检测方法的Meta回归分析结果

Tab.4 Combined results of the two test methods表4 2种检测方法的合并诊断效能

3 讨论

美国癌症学会（ACS）发布的“全球癌症统计2018”显示，在全球185 个国家的860 万例女性癌症新发病例及420 万癌症死亡病例中，宫颈癌的发病率（6.6%）、死亡率（7.5%）均排名第4 位［19］。2019 年中国国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示，2015 年我国宫颈癌发病率位居女性恶性肿瘤第6位，死亡率位居女性恶性肿瘤第8 位。普及防癌知识，开展宫颈癌筛查，做到早发现、早诊断、早治疗可以有效降低宫颈癌的发病率、死亡率，尤其是在经济卫生条件相对落后的农村地区。宫颈脱落细胞的细胞学检测是目前宫颈癌筛查策略的基础，按照现有的筛查策略，临床医师会建议细胞病理诊断为ASCUS的患者进一步接受HPV检测。

目前研究一致认为，宫颈癌的发生、发展与高危型HPV 的感染有关［20］。但女性一生中感染HPV 的概率高达80%，其中绝大部分感染是一过性的，2～3年可被自身免疫清除，超过91%的ASCUS及低度鳞状上皮内病变（LSIL）患者HPV 感染在6～24 个月自动清除［21］。在宫颈上皮细胞癌变过程中，HPV 需将其E6/E7 DNA 整合入宫颈上皮细胞基因组中，转录生成E6/E7癌蛋白，两者分别与抑癌蛋白p53和pRb结合，干扰细胞周期调节，导致细胞无限分裂最终引起癌变［22］。E6/E7 mRNA 正是病毒癌基因的转录产物，其在宫颈上皮细胞的过度表达是导致宫颈癌的关键因素［23］。

Fig.3 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV E6/E7 mRNA test图3 HPV E6/E7 mRNA检测诊断比值比的Meta分析

Fig.4 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV DNA test图4 HPV DNA检测诊断比值比的Meta分析

Fig.5 SROC curve of HPV E6/E7 mRNA diagnosis for CINⅡ+in research objects图5 研究对象中HPV E6/E7 mRNA检测诊断CINⅡ+的SROC曲线

Fig.6 SROC curve of HPV DNA diagnosis for CINⅡ+in research objects图6 研究对象中HPV DNA检测诊断CINⅡ+的SROC曲线

Fig.7 Funnel plots for assessment in published literature图7 发表偏倚评估漏斗图

近年来，文献报道了HPV E6/E7 mRNA 检测在ASCUS人群中的分流诊断价值，但与HPV DNA检测相比，其诊断效能仍存争议。本研究共纳入15项研究，共计4 019 例患者，系统比较2 种检测方法对ASCUS 人群的分流诊断价值。Meta 分析结果显示，与HPV DNA 检测相比，HPV E6/E7 mRNA 检测的合并敏感度低、特异度高，提示其在ASCUS 人群中检出CINⅡ+的价值优于HPV DNA检测，这与国外一篇荟萃分析［24］结论一致，分析其原因可能与2 种检测方法的检测原理有关。HPV DNA 检测是对宿主细胞内游离状态与整合状态的HPV DNA进行检测，无法判断HPV感染阶段和病毒癌基因的活性情况；而HPV mRNA检测仅检测整合状态的病毒RNA片段，大大降低了假阳性出现的概率。同时，根据SROC曲线，2种检测方法的AUC 分别为0.847和0.760，提示HPV E6/E7 mRNA 检测的诊断效能优于HPV DNA检测，有望成为ASCUS患者分流的一种更为有效的检测方法。此外，HPV E6/E7 mRNA 检测的阳性似然比高于HPV DNA 检测，分别为2.40 和1.59，提示E6/E7 mRNA 阳性的ASCUS 患者较HPV DNA阳性者更易出现CINⅡ+病变。因此，对于HPV E6/E7 mRNA 阳性的ASCUS 患者，应引起警惕，并采取更积极的治疗方案，从而改善患者的临床结局；但HPV E6/E7 mRNA检测敏感度低可能会引起一定的漏诊，并且国内外对其定量检测的最佳诊断临界点尚存争议［25］。因此，在细胞学检查的基础上，开展HPV E6/E7 mRNA 检测对ASCUS 人群进行分流，尚需高质量、大样本的临床数据支持。临床上应对各项HPV 检测技术进行客观、科学的评价，并结合中国医疗现状，制定出适应我国国情的宫颈癌筛查策略。

在异质性分析时，亚组分析结果显示，HPV E6/E7 mRNA 检测研究间的异质性可能与检测原理的差异有关；而HPV DNA检测研究间的异质性可能与研究样本量有关。通常小样本研究可能会呈现更好的诊断准确性，纳入研究的检测原理不同、选择试剂盒的差异甚至检测仪器的不同，均会引起测量偏倚，导致异质性的出现。由于本研究进行Meta 回归时未能找出异质性的主要来源，故影响结果的准确性。本研究尚有一定局限性：（1）纳入的研究仅为中、英文文献，其他语种文献未能纳入。（2）部分纳入的研究质量不高，未提及是否使用盲法。（3）纳入的研究检测原理不尽相同，虽进行了亚组分析，但异质性仍无法消除，可能与研究设计不同、研究对象的种族年龄存在差异有关。

综上所述，对于ASCUS患者，HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA检测在诊断CINⅡ+的宫颈病变中，均具有一定的诊断价值，HPV E6/E7 mRNA 检测的诊断效能优于HPV DNA 检测，尤其是其检测特异度较高。由于纳入研究的对象和质量有限，上述结论仍有待进一步研究验证。