lncRNA LUCAT1对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

王辉，田伟，杨建兵，李占琦，高卫军

陕西省核工业二一五医院泌尿外科1、病理科2，陕西 咸阳 712000

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，传统的手术、化疗治疗手段虽有一定疗效，但仍存在不良反应大、部分患者无法耐受、肿瘤复发率和进展率较高等缺点[1]。近年来，靶向治疗成为新的治疗方法，相较于传统化疗，其不仅提高了疗效，还具有明显优势[2]。研究发现长链非编码RNA(LncRNA)可通过影响肿瘤细胞的生长、浸润和转移促进肿瘤的发生发展，异常表达的LncRNA 与膀胱癌的发生发展也密切相关[3]。作为非编码RNA大家族的miRNA，其同样也与膀胱癌的进展密切相关，可作为诊断和治疗膀胱癌的新靶点[4]。研究发现LUCAT1在非小细胞肺癌中上调表达，敲低LUCAT1 可抑制细胞增殖[5]；LUCAT1 通过 miR-200c/ABCB1调节骨肉瘤中的甲氨蝶呤抗性[6]；上调lncRNA LUCAT1 能通过调控miR-181a 的表达促进宫颈癌的增殖，迁移和侵袭[7]。miR-493-5p 在前列腺癌中表达下调，过表达miR-493-5p 可抑制前列腺癌细胞的增殖、上皮间充质转化(EMT)和迁移侵袭[8]；miR-493-5p通过靶向VAMP2抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，并促进细胞凋亡[9]。而LUCAT1和miR-493-5p对膀胱癌的发生发展的影响及其在膀胱癌中的作用机制尚不清楚。本实验旨在研究LUCAT1 和miR-493-5p 对膀胱癌增殖和凋亡的影响及LUCAT1是否通过靶向调节miR-493-5p影响其下游的基因进而影响膀胱癌的进展。

1 材料与方法

1.1 材料 膀胱癌细胞J82、5637、BIU-87 和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1均购自上海冠导生物工程有限公司；胎牛血清、RPMI-1640 培养基购自上海恒渡生物科技有限公司；Trizol试剂、荧光定量PCR试剂盒购自上海优宁维生物科技股份有限公司；BCA试剂盒购自上海榕柏生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海群己生物科技有限公司；MTT试剂盒购自上海圻明生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 膀胱癌细胞J82、5637、BIU-87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1 在RPMI-1640 培养基(含10%胎牛血清)中培养，每天换液一次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染与分组 取对数生长期膀胱癌细胞5637，无血清培养12 h 后转染；将si-NC、si-LUCAT1、pcDNA-NC 和 pcDNA-LUCAT1 分别转染至膀胱癌细胞 5637 中，记为 si-NC 组、si-LUCAT1 组、pcDNA-NC 组和pcDNA-LUCAT1 组；未进行任何处理的正常膀胱癌细胞5637 做为空白对照组(Control)；将si-LUCAT1 分别与 anti-miR-NC 和 anti-miR-493-5p 共同转染至膀胱癌细胞5637 中，记为si-LUCAT1+anti-miR-NC 组和 si-LUCAT1+anti-miR-493-5p 组，转染均按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.2.3 qRT-PCR 检 测 miR-493-5p 和 LUCAT1 表达水平 收集细胞提取总RNA，合成cDNA，按试剂盒说明进行PCR，以β-actin为内参，相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 收集细胞提取总蛋白，BCA 法定量。经SDS-PAGE、转膜、封闭，加入一抗(1：1 000)4℃孵育过夜，加入二抗(1：2 000)室温孵育2 h，显影、定影、成像，检测蛋白条带吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。

1.2.5 MTT检测细胞活性 收集培养24 h、48 h、72 h的细胞，按试剂盒说明进行操作，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞增殖活力(%)=实验组OD 值/空白对照组OD值×100%。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，漂洗后按试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min；上流式细胞仪检测。

1.2.7 荧光素酶报告实验检测LUCAT1 对miR-493-5p的靶向调控 构建有miR-493-5p结合位点的LUCAT1 野生型和突变型荧光素酶表达载体(LUCAT1-WT 和 LUCAT1-MT)，将其分别与 miR-NC和miR-493-5p 共转染至细胞；按说明书要求检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0 统计学软件-分析数据，计量资料符合正态分布，以均数±标准差()表示，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LUCAT1 和miR-493-5p 在膀胱癌细胞株和正常膀胱上皮细胞中的表达水平 与正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1 相比，膀胱癌细胞J82、5637、BIU-87中LUCAT1 mRNA的表达水平明显升高，miR-493-5p的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图1。选择表达变化最明显的5637 细胞用做后续试验。

图1 LUCAT1和miR-493-5p在膀胱癌细胞株中的表达水平

2.2 沉默LUCAT1 对膀胱癌细胞5637 增殖和凋亡的影响 与si-NC 组相比，si-LUCAT1 组膀胱癌细胞5637中LUCAT1 mRNA的表达水平显著降低，细胞活性明显降低，凋亡率明显升高，CyclinD1 表达水平明显降低，Caspase-3 表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

2.3 LUCAT1 和miR-493-5p 间的相互调控关系 TargetScan 预测显示 LUCAT1 与 miR-493-5p 存在结合位点(图3A)。荧光素酶报告实验结果(图3B)显示，相较于miR-NC组，miR-493-5p组LUCAT1-WT膀胱癌细胞5637的荧光素酶活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，而 LUCAT1-MT 膀胱癌细胞 5637的荧光素酶活性差异无统计学意义(P＞0.05)。相较于pcDNA-NC 组，pcDNA-LUCAT1 组膀胱癌细胞 5637中miR-493-5p 的表达水平明显降低；相较于si-NC组，si-LUCAT1 组膀胱癌细胞 5637 中 miR-493-5p 的表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图3C。

图3 LUCAT1和miR-493-5p间的调控关系

2.4 抑制miR-493-5p表达逆转沉默LUCAT1对膀胱癌细胞5637增殖和凋亡的影响 与si-LUCAT1+anti-miR-NC 组相比，si-LUCAT1+anti-miR-493-5p 组膀胱癌细胞5637细胞活性明显升高，细胞凋亡率明显降低，Cyclin D1蛋白的表达水平明显升高，Caspase-3蛋白的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

2.5 抑制miR-493-5p表达逆转沉默LUCAT1对JAK/STAT 信号通路的影响 与si-NC 组相比，si-LUCAT1 组膀胱癌细胞 5637 中 p-JAK2、p-STAT 蛋白的表达水平明显降低，与si-LUCAT1+anti-miR-NC组相比，si-LUCAT1+anti-miR-493-5p 组膀胱癌细胞p-JAK2、p-STAT 蛋白的表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图5。

图4 抑制miR-493-5p表达逆转沉默LUCAT1对膀胱癌细胞5637增殖和凋亡的影响

图5 抑制miR-493-5p表达逆转沉默LUCAT1对JAK/STAT信号通路的影响

3 讨论

膀胱癌是我国发病率和死亡率最高的泌尿生殖系统肿瘤，严重威胁着人们的健康；靶向治疗作为一种新的治疗模式，有望应用在膀胱癌的治疗中[10]。近年来研究发现lncRNA在膀胱癌的发生发展中扮演重要角色，lncRNA LUCAT1 是一种不良的预后因子，可在体外和体内促进肾癌细胞增殖[11]；lncRNA LUCAT1还能促进胃癌细胞的侵袭和迁移能力[12]。LUCAT1在透明细胞肾细胞癌中上调表达，并且与其不良预后显著相关；LUCAT1通过AKT/GSK-3β信号传导途径促进透明细胞肾细胞癌的增殖和侵袭[13]。此外，LUCAT1 在食管鳞状细胞癌中也上调表达，LUCAT1 敲低可减少KYSE-30细胞增殖，诱导细胞凋亡[14]。敲除lncRNA LUCAT1 通过调节miR-375 能抑制神经胶质瘤细胞的活力和侵袭[15]。本实验结果表明，lncRNA LUCAT1 在膀胱癌细胞中同样高表达，沉默LUCAT1 可抑制膀胱癌5637细胞增殖，促进细胞凋亡。

lncRNA和miRNA两者一般通过相互作用参与表观遗传、转录及转录后调控，进而参与恶性肿瘤的发生发展[16]。本实验发现LUCAT1靶向负调控miR-493-5p的表达。研究报道miR-493-5p 高表达与非小细胞肺癌的临床预后呈正相关[17]。miR-493-5p通过靶向FUT4可减弱人乳腺癌的侵袭性和致瘤性[18]；miR-493-5p可通过AKT/GSK-3β/Snail信号传导抑制前列腺癌的上皮-间质化[19]。本实验研究结果发现，miR-493-5p在膀胱癌细胞中低表达；且抑制miR-493-5p 表达能逆转沉默LUCAT1 对膀胱癌细胞5637 的增殖抑制和凋亡促进的作用，还逆转了沉默LUCAT1对JAK2/STAT信号通路的抑制作用。

STAT3 是细胞内重要的转录因子，JAK 磷酸化能激活STAT3，JAK/STAT 信号通路在肿瘤的发生发展、侵袭、转移起着关键作用，JAK2/STAT3是其中重要的一个重要信号通路，阻断该信号通路可以抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡[20]。研究发现miR-153 可通过JAK/STAT信号通路可调控膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力[21]；白藜芦醇通过下调p-STAT3 的表达来抑制JAK/STAT3信号通路，从而抑制膀胱癌细胞的生长[22]；白花蛇舌草也能通过JAK2/STAT3 通路诱导膀胱癌T24细胞凋亡[23]。本实验中，沉默LUCAT1会抑制Cyclin D1、p-JAK2、p-STAT 蛋白的表达，即抑制 JAK2/STAT3信号通路的激活，miR-493-5p抑制表达会逆转沉默LUCAT1对JAK2/STAT信号通路的抑制作用。

综上所述，沉默lncRNA LUCAT1 可抑制膀胱癌细胞增殖，促进细胞凋亡，其机制可能与上调miR-493-5p 及抑制JAK2/STAT 信号通路有关，将可为膀胱癌的预防和治疗提供新靶点。