一种三联乳酸菌的体外降胆固醇和抗氧化能力研究

黄元霞 彭传海 丁宁 邱忠平 李星 邹美慧

（1. 西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031；2. 中铁二局中心医院，成都 610081）

胆固醇广泛存在于人及动物体内，是体内组织细胞的基本活性物质。而机体内胆固醇过多可能会导致动脉脂质沉积，引发高脂血症，从而提高心脑血管类疾病的发病率。因此，降低血清胆固醇对于防治高脂血症、降低心脑血管疾病的发病率具有重要的意义［1］。可食用乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是目前公认安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）等级的食品微 生物［2］，可利用菌体本身以及在肠道中分泌胆盐水解酶（Bile salt hyelrolase，BSH）来降低血清胆固醇，从而起到防治高脂血症的作用［2-3］。BSH可将体内的复合胆盐水解为游离胆盐，促进游离胆盐与胆固醇生成沉淀，沉淀不易被肠道吸收，会随粪便排出体外，从而降低胆固醇含量［4］。乳酸菌在生长过程中会产出一种天然存在的功能性、非蛋白质氨基酸——γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA），具有降血脂、降血压等功能，可辅助治疗心脑血管疾病［5］。此外，乳酸菌具有一定的抗氧化活性，可清除体内的自由基，进而改善氧化应激，平衡脂类代谢，减少高脂血症的发生［6-7］。因此，乳酸菌作为一种功能性的保健食品，具有重要的开发潜力。

目前乳酸菌常常是降胆固醇和抗氧化的重要益生菌，但是多以单菌株的研究为主［8］，而对于乳酸菌制剂的降胆固醇以及抗氧化研究鲜见报道。干酪乳杆菌和哈伯氏乳杆菌具有抗氧化、降胆固醇、增强人体免疫等较多益生性能，且其效果较强，是目前市面上活菌饮料和乳制品中较常用的乳酸菌［9-10］；屎肠球菌是目前抗逆性较强的乳酸菌之一，其易在体内定植，且仍具有较多的益生性能［11］；同时干酪乳杆菌、哈伯氏乳杆菌和屎肠球菌在发酵过程中均可产有机酸等代谢产物，使得发酵液的pH降低，为乳酸菌提供合适的生长条件，抑制其它有害微生物的生长，这对于延长乳酸菌制剂的保存时间具有重要的意义［10-11］。

基于上述3种乳酸菌的益生性能，本研究从西南交通大学资源微生物技术研究中心实验室筛选保藏的若干株乳酸菌中，通过研究各菌株的益生性能，获得有较优降胆固醇能力和抗氧化活性的干酪乳杆菌S1、屎肠球菌S4和哈伯氏乳杆菌S6，制备为三联乳酸菌，考察其对胃肠道环境的适应性、降胆固醇能力、GABA的含量以及抗氧化活性，以期为后续研究和开发功能性微生态制剂或保健食品提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：干酪乳杆菌S1、屎肠球菌S4和哈伯氏乳杆菌S6均筛选自市售酸奶、乳酸菌饮料，由西南交通大学资源微生物技术研究中心保藏2年，且能稳定传代5代以上，各菌的16S rDNA在GenBank的登陆号分别为MN809276、MN809277和MN809279。金双歧三联活菌制剂（内蒙古双歧药业有限公司）。

培养基以及人工胃肠液制备［12］：MRS培养基用于乳酸菌的培养与计数。高胆固醇培养基（0.1 mg/mL）用于乳酸菌降胆固醇能力检测。人工胃液：NaCl 0.20%、胃蛋白酶0.30%，HCl调pH为 2.5，过滤除菌备用。人工肠液：胰蛋白酶 0.10%，胆盐0.30%，调pH至8.0，过滤除菌备用。

1.2 方法

1.2.1 三联乳酸菌的制备 将冷冻干燥保存的供试菌株，使用前接种至MRS液体培养基中，37℃培养24 h，活化菌株。利用牛津杯法对3株菌株进行拮抗实验［13］。调节菌悬液活菌数，使得干酪乳杆菌S1、屎肠球菌S4和哈伯氏乳杆菌S6的菌悬液的活菌数为2.0×109CFU/mL。然后按1∶1∶1混合得到三联乳酸菌。将市售金双歧活菌制剂作为对照组，按上述方法将其菌悬液活菌数调至相同。

1.2.2 人工胃肠液耐受性 将其接种于MRS培养基中，37℃培养24 h，将1 mL发酵液与9 mL人工胃液混匀置37℃摇床中。然后移取1 mL处理2 h的含菌人工胃液与9 mL pH 6.8的人工肠液混合，分别在0 h、2 h、6 h、10 h、24 h取样，按平板计数法测定其活菌数，按1式计算存活率［12］。

式中N1：人工胃肠液处理N个小时的活菌数；N0：0 h活菌数

1.2.3 降胆固醇能力

1.2.3.1 总降胆固醇能力 将其接种于高胆固醇MRS培养基中，在37℃摇床中培养24 h，采用硫酸铁铵法，测定其上清液中的胆固醇浓度［14］。

1.2.3.2 BSH比活测定 采用茚三酮显色法［15］，将其接种于MRS培养基中，37℃培养24 h，发酵液离心用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，之后用其调菌体浓度在OD620下值为1-2，加入25 μL、20 mmol/L的溶菌酶破壁，37℃水浴1 h。取0.1 mL上清粗酶液+1.8 mL（pH 6.0）缓冲液+0.1 mL 0.2 mmol/L的牛磺脱氧胆酸钠溶液，37℃水浴30 min，加1.5 mL、15%三氯乙酸终止反应，菌液离心，取1.0 mL上清液+2.0 mL茚三酮显色液，沸水浴15 min，在OD570测定吸光值。粗酶蛋白测定：取0.1 mL粗酶上清，加水至1 mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液5 mL，在OD595测定吸光值。

酶活力定义：每分钟每毫升酶液反应产生的牛磺酸的μmol数A。酶比活定义（U/mg）：酶活与每mL酶液所含的蛋白量（mg）之比。

1.2.3.3 胆固醇共沉淀、菌体吸收以及掺入细胞膜含量的测定 参照文献［16］的方法，将其接种于添加和不添加胆盐的高胆固醇MRS培养基中，37℃培养24 h，发酵液离心后，测定上清液胆固醇浓度。取1 mL重悬菌液，加入20 μL、50 mmol/L溶菌酶及50 μL、10%SDS，37℃水浴1 h，然后超声破碎，测定上清液胆固醇浓度，破壁后的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤，沉淀用1.5 mL无水乙醇重悬离心10 min，测定上清液胆固醇浓度，未破壁重悬菌液离心10 min，测定上清中胆固醇浓度。式中A：添加胆盐及胆固醇的培养液上清中胆固醇含量；B：不添加胆盐但添加胆固醇的培养液上清中的胆固醇含量；C：菌体洗涤液上清中胆固醇含量；D：菌体破壁后上清中胆固醇含量；E：破壁后菌泥用乙醇重悬浮后上清中的胆固醇含量；F：胆酸盐与胆固醇共沉淀量；H：菌体吸收去除胆固醇量；I：不接种的添加胆盐的培养基中胆固醇含量；J：细胞膜结合量。

1.2.3.4 BSH比活与降胆固醇能力的相关性分析 以BSH比活（U/mg）为Y，以降解胆固醇的含量为Xi（μg/mL），其中X1代表胆固醇与胆酸盐共沉淀的胆固醇含量（μg/mL），X2代表菌体吸收的胆固醇含量（μg/mL），X3代表细胞膜结合的胆固醇含量（μg/mL）。

1.2.4 GABA的含量 GABA标准曲线：取配置好的 1 mg/mL GABA 标准液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 于 试管中，然后分别加入蒸馏水到1.0 mL，加入0.5 mL 0.01 mol/mL 四硼酸钠，1.0 mL 的6%苯酚入，混匀；加入 1.0 mL 次氯酸钠溶液，混匀后静置8 min，沸水浴 10 min，立即冰浴 5 min，加入2.0 mL的 60%乙醇，在 OD640测量其吸光度。

GABA含量测定：取1.0 mL发酵液抽滤，置于试管中，按照上述方法测量其吸光度，并通过标准曲线计算其含量［17］。

1.2.5 抗氧化活性 样品制备［18］：对活化后的菌种培养液离心10 min，分别收集菌体细胞和发酵上清液；用pH为7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体细胞，再用其对菌体细胞进行重悬，再采用低温超声波破碎，然后离心20 min，收集上清液作为无细胞提取物。还原力：采用铁氰化钾还原法［18］。超氧自由基清除率：采用邻苯三酚自氧化法［18］。羟自由基清除率：利用Fenton反应法［18］。

1.2.6 数据处理 实验数据重复测定3次（n= 3），结果表示为x-±s，采用 SPSS22. 0统计软件进行显著性和相关性分析。P＜0. 01表示差异有统计学意义，误差线用标准误差表示。

2 结果

2.1 乳酸菌拮抗实验

通过牛津杯法分别对3株乳酸菌，进行两两之间的拮抗实验，其结果见图1。

图1 拮抗实验

由图1可知，两株乳酸菌在同一平板上，两两之间并未存在抑菌圈，表明3株乳酸菌之间均无拮抗作用，可用于制备三联乳酸菌。

2.2 人工胃肠耐受性

乳酸菌的人工胃肠液耐受性是其发挥益生特性的重要前提，其在不同时期的人工胃肠液中的存活率如图2。

图2 人工胃肠耐受性

由图2可知，三联乳酸菌在模拟胃肠道环境中的存活率显著高于对照组（P＜0.01）。在人工胃液中，三联乳酸菌存活率达86.34%以上，较对照组高29.47%；转入肠液4 h后，三联乳酸菌和对照组的存活率均有下降趋势，比在人工胃液时分别下降10.69%、11.35%；转入肠液8 h后，三联乳酸菌的存活率较对照组高39.15%；直至24 h时，三联乳酸菌仍处于较高水平，存活率为47.88%，其活菌数为1.25×109CFU/mL，较对照组高172.2%。表明三联乳酸菌的人工胃肠液耐受力较强。

2.3 降胆固醇能力

分别测定三联乳酸菌的总降胆固醇降能力、BSH比活，利用胆固醇共沉淀、菌体吸收以及掺入细胞膜降解胆固醇的含量，分析BSH比活与降胆固醇能力的相关性。

2.3.1 总降胆固醇能力和BSH比活 BSH可分解结合胆酸盐，促进胆固醇与分解后的游离胆酸发生共沉淀或者在人体内促进胆固醇向胆汁酸转化，达到去除胆固醇的目的，其大小可间接表明乳酸菌降胆固醇的能力。由此测定三联乳酸菌的胆固醇去除率和BSH比活，其结果见表1。

由表1可知，将三联乳酸菌和对照组培养24 h后，三联乳酸菌和对照组均有一定的降胆固醇能力，其胆固醇去除率分别为73.43%和58.21%。三联乳酸菌的胆固醇去除率较对照组高26.15%，具有统计学意义（P＜0.01）。由此表明三联乳酸菌的总降胆固醇能力较强。三联乳酸菌和对照组都具有一定的BSH比活，且三联乳酸菌的BSH比活显著高于对照组（P＜0.01），其BSH比活为151.40 U/mg，较对照组高53.29%，与测定的胆固醇去除率一致。表明三联乳酸菌的BSH比活较强，具有降胆固醇优势。

表1 三联乳酸菌胆固醇去除率和BSH比活

2.3.2 胆固醇共沉淀、菌体吸收以及掺入细胞膜含量 乳酸菌去除胆固醇主要依靠共沉淀、菌体吸收以及掺入细胞膜，测定三联乳酸菌的去除比例，结果见表2。

表2 三联乳酸菌体外去除胆固醇分布

由表2可知，三联乳酸菌对于胆固醇的去除主要靠共沉淀作用，其次为菌体吸收，只有少部分掺入细胞膜。其中利用共沉淀可去除56.46%的胆固醇，其胆固醇去除量为26.43 μg/mL；利用菌体细胞能去除39.62%以上的胆固醇，其胆固醇去除量为15.54 μg/mL；而只有3.9%的胆固醇能与细胞膜结合，其胆固醇去除量为1.83 μg/mL。表明三联乳酸菌更易利用BSH分解结合胆酸盐，通过共沉淀去除环境中的胆固醇。

2.3.3 BSH比活与降胆固醇能力的相关性分析 将三联乳酸菌的BSH比活与其共沉淀、菌体吸收以及细胞膜结合去除的胆固醇的相关性进行分析，结果见表3。

表3 BSH比活与降胆固醇能力相关性分析

由表3可知，乳酸菌利用胆固醇与胆酸盐共沉淀去除的胆固醇含量与BSH比活的相关系数r为0.898（P＜0.01），表明BSH比活与胆固醇和胆酸盐共沉淀的含量成正比，乳酸菌利用菌体吸收和细胞膜结合的胆固醇含量与BSH酶比活的相关系数r为-0.528和-0.033（P＞0.01），表明乳酸菌菌体吸收和细胞膜结合的胆固醇含量不受BSH比活的影响。

2.4 GABA的含量

对三联乳酸菌和对照组培养24 h后，测定发酵液中GABA的含量，结果见图3。

图3 GABA含量

由图3可知，三联乳酸菌和对照组均可产一定的GABA。三联乳酸菌的GABA产量达到1.387 mg/mL，较对照组高55.59%，具有统计学意义（P＜0.01）。GABA含量的测定对红曲菌的研究较多，对乳酸菌研究较少。而本研究表明三联乳酸菌具有GABA含量，可达到一定降血脂和降血压的作用。

2.5 抗氧化活性

以还原力、超氧自由基清除率和羟自由基清除率为抗氧化活性指标，对三联乳酸菌的菌体细胞、发酵上清液和无细胞提取物3个部位的抗氧化性进行检测，结果见图4。

图4 抗氧化活性

由图4可知，三联乳酸菌和对照组均表现出一定的抗氧化活性，其还原力和超氧自由基清除率主要存在于发酵上清液和无细胞提取物，而羟自由基清除率主要存在于菌体细胞。三联乳酸菌总体抗氧化活性显著高于对照组（P＜0.01）。三联乳酸菌无细胞提取物的还原力最高为1.52，较对照组高14.29%，无细胞提取物超氧自由基清除率最高为95.68%，较对照组高64.12%，菌体细胞羟自由基清除率最高为89.93%，较对照组高13.42%。因此，三联乳酸菌具有较好的抗氧化活性。

3 讨论

三联乳酸菌有较强人工胃肠耐受能力，有利于在人体肠道内定植。乳酸菌进入人体之后，需经胃液的胃酸环境（pH 3.0）和胃蛋白酶，肠液的高胆盐浓度（0.03%-0.3%）和胰蛋白酶后，定植于肠道，进而发挥其益生功能［9-10］。本研究中三联乳酸菌在人工胃液中经2 h后存活率达86.34%，在人工胃肠液处理24 h后，存活率为47.88%。Goldin等［19］和赵芳等［12］研究了LGG菌株在人工胃液中处理2 h的存活率分别为62.96%和69.78%，三联乳酸菌表现出较强的人工胃液适应性，且显著高于对照组。由于三联乳酸菌可通过菌株间的协同作用，利用自身的双组分信号转导系统、细胞膜组成变化和维持胞内外pH平衡等机制对酸性环境进行调剂［8-9］，进而增强在人工胃液中的存活率。其次三联乳酸菌BSH活力较强，可提高乳酸菌的肠道黏附性，而密致细胞表层蛋白也可对抗菌物质起到一定阻碍作用，由此三联乳酸菌在人工胃肠液中的活菌数较高，适应性较强［20］。

三联乳酸菌主要利用共沉淀和菌体吸收去除胆固醇。本研究表明三联乳酸菌的总胆固醇去除率为73.43%，产GABA含量为1.387 mg/mL。韦云路等［21］报道长双歧杆菌TTF的胆固醇去除率为24.8%，印伯星等［22］发现鼠李糖乳杆菌LV108的胆固醇去除率为51.93%，表明三联乳酸菌有较强的降胆固醇能力，且显著高于对照组。三联乳酸菌主要通过以下几种机制去除胆固醇：通过共沉淀作用去除胆固醇。三联乳酸菌分泌的BSH比活高达151.40 U/mg，BSH可将结合胆盐水解生成游离胆酸，进而促进胆固醇共沉淀，因此BSH比活与胆固醇共沉淀的含量成正相关；其次游离胆酸不易被肠道吸收，干扰体内的干肠循环，进而引起与胆固醇代谢相关受体的活性变化，最终降低肠道对胆固醇的吸收［4］。通过菌体吸收和少量掺入细胞膜去除胆固醇。三联乳酸菌易在肠道内定植，微生物数量和生理活性相对较高，通过菌体间的协同作用可提高菌体对胆固醇的吸收，从而获得碳源和能量，而细胞膜结合少部分胆固醇后，也可能将其同化为细胞膜的组成成分［5，23］。

三联乳酸菌有较强抗氧化活性，其还原力和超氧自由基清除主要利用无细胞提取物，而羟自由基清除主要利用菌体细胞。清除自由基可改善体内的氧化应激，平衡体内的脂肪代谢，避免高脂血症的形成［7］。本研究表明三联乳酸菌无细胞提取物的还原力达到1.52，超氧自由基清除率达95.68%，发酵上清液中羟自由基清除率为85.96%。何书美等［24］研究了不同品牌酸牛奶中乳酸菌液的还原力为0.7-0.8，李晓军等［25］筛选的发酵乳杆菌La5的超氧自由基清除率为22.29%，三联乳酸菌表现出较强抗氧化活性，且显著高于对照组。由于三联乳酸菌耐受能力强，微生物数量多，在发酵过程中产生的胞内抗氧化物酶、螯合金属离子的天然物质以及胞外多糖等代谢产物含量会相对增多，进而提高还原力以及对自由基的清除能力，这对高脂血症以及心脑血管疾病的预防有着重要的意义［26］。

4 结论

三联乳酸菌人工胃肠耐受性较好，且降胆固醇和抗氧化活性也较强。在人工胃肠液处理24 h后，存活率为47.88%，活菌数为1.25×109CFU/mL；降胆固醇能力最强为73.43%，BSH比活为151.40 U/mg，GABA的含量为1.387 mg/mL；无细胞提取物的还原力和对超氧自由基清除率最高为1.52和95.68%，菌体细胞对羟自由基清除率最高为89.93%，是一种较优的三联乳酸菌制剂。