肝素结合蛋白在脓毒症中的应用研究进展

陈燕，杨轶轩

（重庆医科大学附属第二医院感染科，重庆）

0 引言

脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍[1]。其病理生理机制包括宿主反应、先天免疫、凝血异常、炎症反应、凝血与炎症网络、免疫抑制、器官功能障碍、基因多态性等。其发病率高、病情危重、死亡率高，韩国的一项基于医疗保险报销数据库的全国性回顾性观察性研究表明，在韩国脓毒症发病率从2007年的173.8/10万增加到2016年的233.6/10万，与脓毒症相关的总住院死亡率高达29.0%[2]。一项新的系统综述研究表明，脓毒症识别后1h内上抗菌药物对于死亡率的改善是最佳的[3]。脓毒症的早期临床症状特异性不高，近1/3的严重脓毒症患者在入院时没有表现出组织器官功能障碍的征象，随后却在最初的急诊科评估后24小时内进展为严重脓毒症[4]，所以预测或是早期诊断脓毒症就显得尤为重要。脓毒症早期诊断和疗效评估的生物标志物大约有两百多种[5]，临床上至今仍缺乏特异性的诊断脓毒症或是疗效监测的生物标志物。1985年如Wasson等[6]人所述，一个有用的脓毒症诊断生物标记物需要满足四个标准：（1）生物相关性基础；（2）高灵敏度、高特异性和阳性及阴性预测值高；（3）机构之外的重复性好；（4）其他独立患者人群的有效性。其它所有提出的诊断生物标记物都不满足所有这些标准。HBP符合这一标准。

1 HBP结构

HBP是Shafer等[7]首次从人中性粒细胞颗粒中分离纯化，因其带正电荷、有抗菌活性、相对分子量为3700，故称为阳离子抗菌蛋白（CAP37）和天青杀素。成熟（活性）CAP37为单链多肽，由221或222个氨基酸残基组成，相对分子质量为24000。Pohl等[8]测定了CAP37的氨基酸序列，CAP37是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族中的一员，具有多种配体的结合位点（肝素、脂质A、脂多糖等），丝氨酸蛋白酶在炎症的各个方面都很重要[9]，其与人中性粒细胞弹性蛋白酶的同源性最高（45%），与蛋白酶3、组织蛋白酶G的序列同源性分别为为42%、32%；CAP37有3个糖基化位点，分别位于第100、114和145号残基上；有与弹性蛋白酶、补体因子D和糜蛋白酶结构中相同的8个严格保守的半胱氨酸残基[10]，另CAP37像弹性蛋白酶一样具有类糜蛋白酶类型的二硫键配对，二硫键的存在对于抗菌作用是必要的；最关键的序列差异涉及催化残基，因其催化三联体中的两个氨基酸残基被替换，使其无酶活性；但其仍能与胰蛋白酶抑制剂（BPTI）结合，使得BPTI（牛胰蛋白酶抑制剂）亲和色谱法可以提纯出HBP，证实HBP与BPTI结合是作用于活化中心三联体上的。蛋白质的一侧存在一个由两簇碱性氨基酸残基参与组成的一个高度阳离子的结构域，该结构域结合肝素和发挥抗菌活性，碱性氨基酸残基还可能与带负电荷的内皮细胞膜蛋白多糖分子结合[11]，从而诱导内皮细胞的构象变化。成熟CAP37蛋白是一种具有交替的疏水和亲水结构域的蛋白质，疏水结构域的存在使其能更好地进入脂质双层，增强了它们对细胞膜和随后的趋化结合的亲和力。

2 HBP定位

嗜天青颗粒存在于原始粒细胞及早幼粒细胞中，而分泌型小泡在中性粒细胞成熟的末期才出现。HBP在中性粒细胞成熟过程中被合成，在嗜天青颗粒、分泌小泡、质膜上储存量分别约为74%、18%、8%。由于它储存在中性粒细胞的嗜天青颗粒和靠近细胞膜附近的分泌小泡中，故其易于活化，中性粒细胞受刺激后所分泌的HBP是向细胞外释放的，所以我们可以通过检测技术了解血浆中的HBP水平。其双重定位表明该蛋白在中性粒细胞中具有多种功能。从分泌小泡释放容易调动的HBP，在炎症早期可能具有重要作用；另一方面，嗜天青颗粒释放率低，只有当中性粒细胞浸润组织时才释放，此时中性粒细胞源性HBP与吞噬体融合后，可能与内部细菌发生密切接触，产生重要的抗菌作用[12]。

3 HBP的分泌及功能

中性粒细胞活化及释放HBP是对感染作出的反应。趋化因子从感染部位释放，以响应入侵病原体的组分与模式识别受体的结合[13]。这些趋化因子如IL-8激活中性粒细胞并导致HBP释放[14]。细菌蛋白也可以直接激活中性粒细胞并释放HBP[15-18]，包括来自化脓性链球菌的M1蛋白[15]，来自猪链球菌的溶血素[16]，来自铜绿假单胞菌分泌物[18]和来自金黄色葡萄球菌的酚溶性调节素α4[17]。内皮细胞是中性粒细胞分泌小泡释放的HBP的第一个靶点，当其与内皮细胞表面的细胞粘附分子接触时，中性粒细胞也被激活[19]，随后的HBP释放导致内皮通透性增加，促进中性粒细胞及单核细胞向感染部位外渗[20]。储存在嗜天青颗粒中的HBP，只有在中性粒细胞渗入组织后才释放[12,21]。因此，HBP既在血液中释放，也在组织中释放，在那里它对几种细胞类型产生影响。

HBP是一种具有抗菌、趋化多种白细胞、增加血管内皮通透性等多种功能的炎性蛋白。它能够杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和白色念珠菌[7,22]，通过作为调理素增强对病原体的吞噬作用[23]；其抗菌活性主要是针对革兰氏阴性细菌，可能是通过与脂多糖（LPS）类脂A结合而启动的，HBP可能在感染过程中发挥中和LPS的作用[24]。除了与病原体的相互作用外，HBP还影响宿主中几种不同类型的白细胞以增强免疫反应。例如作为单核细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞的趋化剂[14,25]，从而增强白细胞募集和细胞因子释放。穿过内皮屏障，循环中的白细胞才能外渗至感染部位[26]；内皮屏障功能的丧失是脓毒症发生的一个重要因素[27]；HBP影响内皮细胞，首先通过诱导内皮细胞表达ICAM1，PECAM-1和整合素a3和b1，这有助于中性粒细胞粘附到内皮表面[28]；HBP然后诱导内皮细胞骨架的重排[20]、细胞收缩和细胞之间的间隙形成[29]，导致内皮通透性增加。HBP也针对内皮细胞中的线粒体，引起形态学变化，降低细胞色素c氧化酶亚基II的表达，降低线粒体膜电位[30]，对线粒体起到抗凋亡的保护作用，有助于在体内中性粒细胞激活的情况下将内皮细胞的损伤降至最低。

4 HBP在脓毒症中的应用

HBP是中性粒细胞中唯一从分泌囊泡分泌到环境中的颗粒蛋白[24]，因此强调了其在炎症反应中具有重要作用。有研究表明，铜绿假单胞菌弹性蛋白酶是一种有效的金属蛋白酶，可以降解像LL-37这样的抗菌肽，却不能降解HBP，表明HBP在高度蛋白水解的环境中是稳定的[18]。这些都使得HBP能在血液循环中被检测到。

从生物学上看，HBP是一种早期和预测性的生物标志物，因为它是预先合成的，并通过迁移中性粒细胞对细菌感染的反应迅速动员起来。HBP储存在中性粒细胞的分泌小泡和嗜天青颗粒中[12]，中性粒细胞中的分泌小泡在其激活时会出现快速的胞吐，仅在吞噬细菌30分钟后就有89%的HBP胞吐，这比其他中性粒细胞颗粒蛋白的比例要大得多[24]。HBP导致血管渗漏和水肿形成，并对各种白细胞和上皮细胞具有促炎作用。血管屏障功能破坏和细胞炎症反应的失调可导致器官功能衰竭。HBP在严重细菌感染的病理生理学中起主要作用，因此是一种潜在的诊断标记物和脓毒症治疗的靶点。

HBP能诊断脓毒症、预测脓毒性休克的发生及判断预后。健康人血浆HBP浓度很低，一般不超过10ng/mL。2009年Linder等[31]认为血浆HBP水平大于15ng/mL是严重脓毒症诊断的最佳实验室指标，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值均高，分别达87.1%、95.1%、88.4%、94.5%。在26例感染性休克患者中，24例（92.3%）在入选时血浆HBP水平就已升高；在其余44例严重脓毒症患者中，37例（84.1%）血清水平升高；在100名非严重脓毒症患者中，只有7名患者的HBP水平升高。表明HBP血浆水平升高与低血压、器官功能衰竭的发生密切相关。研究中的一些登记患者后来被诊断为非传染性疾病，在这20名患者中，有11名因各种非感染性临床条件导致循环衰竭；与严重感染的患者相比，除1例非感染性低血压患者外，其余患者的HBP水平均较低；这些数据支持HBP在严重脓毒症患者观察到的循环衰竭中具有特定的致病作用这一假设。在所研究的70名有严重脓毒症和感染性休克的患者中，由多种细菌引起的严重感染会导致血浆HBP水平升高，当比较感染了革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的患者的HBP水平时，检测到没有显着差异（未发表的数据）。此外，患者人群中的HBP水平与WBC之间没有相关性，这表明如果HBP要释放到循环中，就需要特定的中性粒细胞激活。在本研究中，在发展为脓毒症的患者中，有80%在满足重度脓毒症标准之前，其HBP水平就升高了（＞30ng/mL），表明HBP可预测脓毒症及器官功能障碍的发生；提示在发烧患者中检测到血浆HBP水平升高应立即提醒临床医生加强液体复苏并开始适当的抗生素治疗，以降低重症脓毒症或感染性休克患者的死亡率[3]。

2012年Linder等[32]研究了ICU中严重脓毒症和感染性休克患者血浆中HBP水平。总共包括179名患者，其中151名有脓毒症（126名有感染性休克，25名有严重脓毒症）和28名非脓毒症危重患者。使用15 ng/mL的截断值和/或HBP/WBC＞2，发现87%的脓毒症患者在研究登记时HBP水平升高。在17.6%的患者中发现一过性白细胞减少症，这是脓毒症相对常见的特征；脓毒症患者出现白细胞减少的可能原因是：脓毒症发作时胞吐增强、骨髓细胞成熟耗竭或停止、中性粒细胞组织分泌等，所以使用HBP/WBC比值可提高诊断一过性白细胞减少症患者是否为脓毒症的敏感性。这项研究表明：与ICU中的非感染性疾病患者相比，严重脓毒症或感染性休克患者的血浆HBP水平显著升高；HBP水平与疾病的严重程度相关；入院时HBP升高与死亡风险增加相关；随着时间的推移升高的HBP可能识别出预后恶化的患者。先前关于HBP作为严重脓毒症的敏感标志物的发现在不同的环境中得到了证实，强调了它作为一种有价值的诊断工具的潜力。

2015年Linder等[33]做了一项前瞻性国际多中心队列研究，地点为瑞典、加拿大和美国的七个不同的急诊科。在674名被诊断为感染的患者中，487名在登记时没有器官功能障碍。在这487名患者中，141名（29%）在72小时的研究期间内出现了器官功能障碍；HBP阈值设定为30 ng/mL 时，141例患者中有110例（78.0%）在发生器官功能障碍前血浆HBP浓度超过阈值。HBP预测进展为器官功能障碍的敏感度为78.0%，特异性为76.3%，与其他生物标志物（PCT、WBC、CRP、乳酸）相比，肝素结合蛋白是进展为器官功能障碍的最佳预测因子（受试者工作特征曲线下面积=0.80）。HBP比其他标记物先升高，可以用其位于分泌颗粒内的位置来解释，分泌颗粒是中性粒细胞激活后最先被动员的。释放后，HBP参与中性粒细胞介导的内皮通透性改变，导致血管渗漏。如果患者样本获取得更接近器官功能障碍的起始点，那么HBP升高的可能性可能会增加。本次研究提出的HBP作为脓毒症标志物的截断值高于以前的研究。

2019年，一项中国的前瞻性队列研究[34]，探讨脓毒症和脓毒性休克国际共识定义（Sepsis-3）中肝素结合蛋白（HBP）在脓毒症和脓毒性休克中的释放水平；脓毒症组56例和脓毒性休克组37例，在125名感染患者中，以HBP28.1ng/mL作为诊断脓毒症的临界值，诊断脓毒症的敏感性为84.9%，特异性为78.3%。阳性预测值为94.0%，阴性预测值为65.9%,这一数值与该研究结果（最佳截断值分别为HBP≥15ng/mL和≥30ng/mL）接近。以≥103.5 ng/mL作为诊断脓毒性休克的临界值，敏感性为67.6%，特异性为82.1%，阳性预测值为71.4%，阴性预测值为79.3%；86人有明确的病原体证据，其中42人感染了革兰氏阳性菌，31人感染了革兰氏阴性菌，革兰氏阳性细菌感染患者与革兰氏阴性细菌感染患者之间的血浆HBP水平无显著差异。

综上所述，HBP是中性粒细胞合成并释放的一种多功能炎性蛋白，它是预先合成的，菌体结构可刺激其从分泌囊泡中快速释放,它作为炎症反应的放大器，并导致毛细血管渗漏，这两者在严重脓毒症时都是高度失调的。因此，HBP在感染早期升高，用于预测器官衰竭及判断预后，在生物学上是非常合理的，多个不同中心的大型临床研究结果均提示其诊断、预测胡判断预后的性能均优于PCT、CRP等传统炎性指标；但其在临床应用中的截断值还需要更多大型临床研究来界定。近年来有研究发现HBP可作为脓毒症的治疗靶点，尚需深入研究。